Используя этот количественный метод проточной цитометрии, исследователи могут рассчитать кинетические и равновесные обычаи введенного в мембранное взаимодействие и оценить количество белка, вносимого участками на мембране PPH. Преимуществами данного метода являются простота и доступность реагентов и оборудования. Этот метод предназначен исключительно для фундаментальных исследований.
Протокол был разработан для изучения белковых липидных взаимодействий при расчете крови и может быть использован в других областях для характеристики взаимодействия белков с различными липидными мембранами. Метод может быть использован для количественной оценки динамики связывания лигандов на различных клетках и типах лигандов. Начните эксперименты по кинетическому связыванию с разбавления фосфолипидных везикул в буфере Тирода до концентрации одного микромоляра и общего объема 250 микролитров.
Затем смешайте флуоресцентный меченый фактор свертывания X или FX FD и концентрацию 500 наномоляров с фосфолипидными везикулами в соотношении один к одному, чтобы получить общий объем 500 микролитров. Немедленно введите 500 микролитров смешанной суспензии в проточный цитометр. При расходе с длиной волны возбуждения 488 нанометров и эмиссионным фильтром 585 нанометров; шириной 42 для канала FL два.
Далее измерьте среднюю флуоресценцию в четвертом канале FL с возбуждением на 633 нанометра и эмиссионным фильтром на 660 нанометров при ширине 20. Когда насыщение связывания достигается быстро, разбавляют образец в 20 раз буфером Тирода и контролируют диссоциацию до тех пор, пока не будет достигнута базовая флуоресценция или плато. Для экспериментов по равновесному связыванию инкубируют пять микромолярных искусственных фосфолипидных везикул с различной концентрацией FX FD от нуля до 1000 наномоляров в буфере Тирода в течение 20 минут.
После инкубации разбавьте каждый образец в 20 раз до конечного объема в 200 микролитров с буфером Tyrode, а затем проанализируйте разбавленный образец методом проточной цитометрии в течение 30 секунд. Для анализа данных экспортируйте эксперименты в формате FSC из программного обеспечения для сбора данных цитометрии в программное обеспечение цитометра для анализа данных. Выбрав файл и щелкнув вкладки Экспорт и FSC файлы.
После этого откройте файлы FCS в программном обеспечении цитометра, выбрав файлы на компьютере и перетащив файлы в рабочую область программы. Для измельчения микровезикул идентифицируют область микровезикул путем флуоресценции липофильного красителя, ДВС-синдром 16 три. Затем используйте кнопку графика на листе, чтобы создать точечный график SSC из FL двух D I C 16 в координатах журнала.
Затем нажмите кнопку прямоугольных затворов, чтобы нарисовать область затвора. Для анализа кинетических экспериментов создают точечный график с использованием координат флуоресценции за время для области везикул. Затем экспортируйте данные об изменении флуоресценции с течением времени в формате CSV; перейдя к выбору образца и щелкнув правой кнопкой мыши на вкладке экспорта, затем выбрав FL четыре раза в параметрах, выберите каталог для сохранения, прежде чем щелкнуть выбрать формат CSV и перейти на вкладку экспорта.
После переноса откройте CSV-файл в статистическом программном обеспечении для расчета простой флуоресценции скользящей средней и времени для каждых 1000 событий аппроксимируйте график зависимости одной скользящей средней флуоресценции от времени при допущении экспоненциальной зависимости и используйте значение для вычисления константы кинетической ассоциации с помощью уравнения. Затем рассчитайте константу кинетической диссоциации, используя уравнение, как описано ранее. Для анализа даты анализа равновесного связывания определяют среднюю флуоресценцию FX FD в области везикул для каждой выбранной концентрации FX FD и затем аппроксимируют зависимость флуоресценции связанного фактора от концентрации добавленного фактора в предположении о связывании одного сайта.
Рассчитайте средние параметры привязки, используя уравнение из трех независимых повторов как минимум. Приступают к приготовлению калиброванных шариков путем инкубации геля фильтрованными тромбоцитами с кальцием IANA 4A двадцать три, сто восемьдесят семь в присутствии 2,5 миллимолярного хлорида кальция в течение 10 минут при комнатной температуре. В активированные тромбоциты добавляют различные концентрации FX FD и инкубируют тромбоциты с двух объемным процентом формальдегида.
Через час остановите реакцию, инкубируя тромбоциты с тремя молярными глицинами и 5% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем очистите смесь от непрореагировавшего красителя центрифугированием в 400 раз g в течение пяти минут. Удалите супернат перед повторным использованием гранулы в буфере Tyrode, содержащем 0,5% BSA.
Затем измерьте уровень флуоресценции калибровочных шариков в каждом образце с помощью спектрофлуорометра, а затем с помощью проточного цитометра. Определите количество бусин в каждом образце с помощью счетчика клеток. Преобразуйте интенсивность флуоресценции каждого соответствующего образца шарика в концентрацию растворимого флуоресцентного красителя с помощью спектрофлуорометра и пересчитайте концентрацию флуоресцентного красителя для числа молекул спектрофлуорометра.
Создайте график зависимости средней флуоресценции шариков в проточном цитометре от количества молекул флурофора для каждого образца. Затем аппроксимируйте зависимость по линейной пропорциональности с помощью анализа фитинга и подгонки линейных табуляций по порядку. Из аппроксимации в уравнении вычисляют коэффициент преобразования средней флуоресценции в сайты связывания.
Позже рассчитайте кажущееся количество сайтов связывания на интересующее везикулу. Репрезентативный анализ показывает засорение искусственных фосфорных липидных везикул размером в один микрометр с включенным липофильным флуоресцентным красителем, красителем I C 16, затвор был установлен на основе образца, содержащего искусственные липидные везикулы того же размера без флуоресцентного красителя. Кинетика связывания белка с везикулами анализировалась на первом этапе путем непрерывного сбора образца.
Полученные данные были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Проточные цитометрические измерения должны начинаться как можно скорее после смешивания растворов и разбавления буфером Tyrode. Предложенный способ может быть дополнен поверхностным плазменным резонансом для исследования введенных мембранных взаимодействий, которые являются высокочувствительными с хорошим временным разрешением и не требуют доставки Основным преимуществом этого метода является его доступность и простота.
