Этот протокол имеет большое значение из-за простоты сенсорной платформы TGT, используемой для изучения перекрестных помех EGFR-интегрина и его влияния на механические силы клеток. Рао наметил исследование EGF-зависимой регуляции клеточной механики. Протокол адаптируется для различных лигандов, типов клеток, парадигм стимуляции и может быть соединен с ТГТ различных порогов напряжения.
Поверхностный синтез может показаться пугающим на первый взгляд. Ключ заключается в том, чтобы быть подготовленным и организованным для точного выполнения сложных этапов, используя контрольный список для подготовки реагентов и расчетов. В первый день поместите до восьми 25-миллиметровых стеклянных крышек в политетрафторэтиленовую стойку.
Поместите стойку в 50-миллилитровый боросиликатный стакан, содержащий 40 миллилитров 200-стойкого этанола. Ультразвук на рабочей частоте 35 килогерц в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Наполните 50-миллилитровый стакан 40 миллилитрами свежеприготовленного раствора пираньи, смешав серную кислоту и перекись водорода в соотношении 3:1 в стакане Pyrex и перемешав стеклянной пипеткой.
Переложите стойку крышки в стакан и высиживайте в течение 30 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу, чтобы вытравить поверхность крышки. После травления переложите крышку скользящей стойки на стакан со сверхчистой водой пинцетом. Визуально осмотрите скольжение крышки, чтобы убедиться, что поверхности выглядят чистыми без узоров или частиц пыли на поверхности стекла.
Переложите стойку крышки на стакан с 200-стойким этанолом и дважды промыть в течение 15 секунд, чтобы уравновесить поверхности до органического растворителя. Переложите стойку крышки в 200-стойкий раствор этанола с 3% APTES в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы силанизировать крышку. Погрузите стойку в чистый стакан с 200-стойким раствором этанола.
Высушите крышку скольжения с помощью газообразного азота с низким давлением выхода. Поместите крышку в 10-сантиметровую полистирольную посуду с куском паррафиновой пленки, уложенным внутри. Добавьте 100 микролитров по два миллиграмма на миллилитр раствора NHS-биотина в ДМСО к четырем покровным листам, помещенным на парафиновую пленку.
Установите бутерброд с четырьмя другими крышками сверху, с двумя скольжениями крышки, обращенными друг к другу с раствором функционализации между ними. На второй день снимите блюдо с четырех градусов цельсия и отделите зажатые крышки. Избегайте царапин или повреждения функционализированной поверхности при разделении сэндвича.
Затем ориентируйте крышку, скользящую в стеллаж с покрытой поверхностью, обращенной друг к другу. Высушите газообразным азотом. Поместите крышку в новую посуду с паррафиновой пленкой внутри.
Добавьте 800 микролитров 0,1% бычьего сывороточного альбумина в 1X PBS к каждому листку крышки. Инкубируют крышку скользящей при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы пассивизировать поверхность и блокировать неспецифическое связывание последующих функционализационных реагентов. Чтобы функционализировать крышку, добавьте 800 микролитров одного микрограмма на миллилитр стрептавидина в 1X PBS при комнатной температуре в течение 45-60 минут.
Соберите датчики TGT в ПЦР-трубку с помощью термоциклера. После инкубации промыть крышку три раза с помощью 1X PBS. Добавьте 100 микролитров предварительно собранных зондов TGT к четырем крышкам и сделайте бутерброды, используя оставшиеся четыре крышки с функционализированной стороной, обращенной к зондам.
Покрытие алюминиевой фольгой. После инкубации отделите бутерброды и трижды вымойте крышку с 1X PBS. Тщательно соберите крышку в предварительно очищенные камеры визуализации.
Чтобы исследовать влияние стимуляции эпидермального фактора роста на механику Cos-7, адгезию и распространение клеток, трипсинизируют клетки Cos-7 с 0,05% трипсина-ЭДТА в течение двух минут. Нейтрализуют трипсин путем промывки HBSS и центрифугирования при 800 г в течение пяти минут. Пластинчатые ячейки при плотности 40 000 ячеек на собранных поверхностях TGT в DMEM дополнены 50 нанограммами на миллилитр EGF или DMEM без EGF.
После инкубации промыть клетки три раза с помощью 1X PBS. Зафиксировать двумя миллилитрами 4%-го параформальдегида в течение 12 минут при комнатной температуре. Стирайте крышку пять раз с 1X PBS с пятиминутными интервалами при комнатной температуре.
По желанию инкубируйте крышку с 50-миллимолярным хлоридом аммония в 1X PBS в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Добавьте буфер А и поместите камеры визуализации с крышками в контейнер влажности. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы блокировать и пропитывать клетки.
Разбавляют первичные антипаксиллиновые антитела в разведении 1:250 в блокирующем буфере. Инкубировать с 200 микролитрами раствора первичного антитела на крышку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Метки клеток одновременно со смесью диконъюгированных вторичных антител козы/кроликов в разведении 1:800 и диконъюгированного фаллоидина в разведении 1:400 в 200 микролитрах блокирующего буфера на крышку.
Мойте поверхности пять раз с 1X PBS с пятиминутными интервалами. Для начала добавьте масло к объективу, очистите нижнюю часть пробоотборной камеры крышки и поместите образец на ступеньку. Сосредоточьтесь на клетке и задействуйте идеальный фокус.
Выровняйте RICM, закрыв и центрировав диафрагму с эпиосвещенной диафрагмой. Сфокусируйте 488-нанометровый лазер на небольшом пятне на потолке помещения и увеличьте угол падения до тех пор, пока не превысите критический угол, одновременно контролируя флуоресценцию на камере в режиме реального времени. Наблюдайте резкое снижение фоновой флуоресценции и одну плоскость в фокусе, когда критический угол превышен.
Идентифицируйте клетки для визуализации с помощью режима реального времени камеры с помощью RICM. Получите изображения RICM и TIRF актина при возбуждении 488 нанометров, напряжения интегрина при возбуждении 561 нанометра и паксиллина при возбуждении 647 нанометров. Получайте изображения последовательно, используя время экспозиции 200 миллисекунд.
Меняйте проскальзывания обложки, фокусировку и повторяйте. Клетки Cos-7 были покрыты на этой поверхности TGT со стимуляцией EGF или без нее для изучения влияния активации EGFR со стимуляцией лигандов на механику интегрина. Если интегрин связывает лиганд и применяет силу, превышающую пороговое напряжение зонда, дуплекс ДНК будет отделяться, что приведет к флуоресценции.
Любой зонд TGT, который не разорвался механической силой, останется нефлуоресцентным. Клетки инкубировали с EGF или без него на поверхностях TGT в течение 60 минут, фиксировали и иммуноокрашивали для отображения распределения фокальной адгезии и организации цитоскелета. На изображении RICM клетка Cos-7, распространяющаяся по поверхности 56-пиконьютонного TGT, была значительно усилена стимуляцией EGF по сравнению с отсутствием стимуляции.
Стимуляция EGF привела к более круговой морфологии, представляющей распространение и рост клеток Cos-7. Флуоресценция от открытых зондов также выше при стимуляции EGF, как это наблюдается на изображении флуоресценции напряжения. Интегральная интенсивность открытых зондов, пропорциональная количеству открытых зондов, была значительно выше при стимуляции EGF, чем без стимуляции.
Всегда помните об ориентации скользящих покрытий, сохраняя функционализированную поверхность обращенной вверх. При разделении бутерброда будьте осторожны, чтобы поверхность не поцарапалась и не повредилась. После поверхностного синтеза можно исследовать цитоплазматические белки, регулирующие адгезию клеток или механическую трансдукцию.
Это позволяет идентифицировать нисходящие сигнальные молекулы, участвующие в оркестровке клеточной механики на плазматической мембране.
