Этот протокол помогает установить связь между молекулярной силой и поведением клетки при качении, а также позволяет пространственно отображать и количественно оценивать адгезию качения на молекулярном уровне. Этот метод позволяет изучать отдельные события адгезии во время фактического скольжения клеток, что позволяет нам непосредственно измерять физиологическую силу молекулярной адгезии. Подготовка поверхности с использованием соответствующей концентрации и времени инкубации на каждом этапе имеет решающее значение для достижения высококачественной функционализации поверхности.
Качество биоконъюгации и надлежащие условия также имеют решающее значение. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, чтобы помочь исследователям воспроизвести этот протокол. В частности, такие этапы, как сборка проточной камеры и постобработка изображений, значительно выиграют от визуальной демонстрации.
Начните с тонкого распределения небольшого количества эпоксидной смолы по обеим сторонам двусторонней ленты лезвием бритвы. С помощью лазера вырежьте ленту с эпоксидным покрытием для создания четырех каналов. Создайте проточную стружку, зажав эпоксидную ленту между затвором с четырьмя отверстиями и крышкой PEG.
Используя наконечник пипетки, примените мягкое давление по длине каналов, чтобы создать хорошее уплотнение, затем отверждайте эпоксидную смолу в течение как минимум одного часа. Выровняйте чип так, чтобы открытие каждого канала располагалось в центрах адаптера. Затем поместите две прозрачные акриловые прокладки поверх чипа.
Приложите сильное давление в середине блока и прикрутите винт на концах каждой распорки. Вкрутите входные отверстия в резьбовые отверстия с другой стороны кронштейна и следите за состоянием уплотнения через прозрачный акриловый блок. Пропустите 200 микролитров промывочного буфера в камеру для проверки утечки.
Если в канале образуются пузырьки, агрессивно протолкните дополнительные 200 микролитров промывочного буфера, чтобы удалить пузырьки. Добавьте 40 микролитров BSA в проточную камеру для предотвращения неспецифического связывания и инкубируйте в течение 10 минут в камере влажности. После инкубации добавьте 40 микролитров в Tween 20 в проточную камеру и снова инкубируйте в течение 10 минут, чтобы еще больше уменьшить неспецифическое связывание.
Затем промыть канал 200 микролитрами промывочного буфера, чтобы удалить все пассивационные агенты. Для функционализации поверхности камеры добавьте 40 микролитров Стрептавидина в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 минут, затем промывайте камеру 200 микролитрами промывочного буфера. Теперь добавьте 40 микролитров гибридизированного белка G-TGT в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 минут.
После промывки с помощью буфера для стирки добавьте 40 микролитров верхней нити белка G-TGT и инкубируйте в течение 20 минут, чтобы завершить любую негибридированную нижнюю прядь TGT на поверхности, а затем промыть буфером для стирки. Наконец, добавьте 40 микролитров P-selectin-Fc в проточную камеру и инкубируйте в течение 60 минут перед промывкой с помощью промывочного буфера. Наполните пятимиллилитровой стеклянный шприц скользящим буфером и постучите по бокам шприца, чтобы выбить и вытолкнуть пузырьки, когда они плывут к кончику.
После введения стерильной иглы в 200-миллиметровый кусок полиэтиленовой трубки подключите иглу к стеклянному шприцу. Закрепите шприц на шприцевом насосе и наклоните шприцевой насос так, чтобы сторона плунжера была приподнята, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в канал. Вставьте конец трубки во входное отверстие проточной камеры.
Вставьте один конец другого 200-миллиметрового куска полиэтиленовой трубки в выпускное отверстие и погрузите другой конец в стакан для отходов. Возьмите один-два миллилитра образца клеточной суспензии и центрифугу, чтобы гранулировать клетки. Извлеките среду и аккуратно повторно суспендируйте ячейки в 500 микролитрах буфера качения.
Осторожно отсоедините трубку от входных отверстий и выходного отверстия и пипетки 40 микролитров клеточной суспензии в проточной камере. Повторно подключите трубку, как описано ранее, гарантируя, что пузырьки не будут введены в канал потока. Начните эксперимент с клеточной прокаткой, запустив шприцевой насос с желаемой скоростью потока.
Наблюдайте за перемещением клеток с помощью микроскопа темного поля с объективом 10X. Как только эксперимент будет завершен, удалите клетки из канала, вливая буфер прокатки со скоростью 100 миллилитров в час, пока поверхность не станет свободной от клеток. Для визуализации локальных следов с помощью DNA-PAINT добавьте в канал 40 микролитров цепи тепловизора DNA-PAINT, приготовленной в буфере DNA-PAINT.
Выполнить флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения с использованием условий, указанных в тексте рукописи. Локализуйте и визуализируйте изображения с сверхвысоким разрешением. Для визуализации длинных дорожек с помощью постоянной маркировки добавьте постоянную нить тепловизора и инкубируйте в течение 120 секунд в буфере T50M5.
Затем промыть канал, влив 200 микролитров промывочного буфера. Запишите изображение с выключенным лазером возбуждения, чтобы получить фоновый шум камеры. Изображение большой площади в виде сетки с помощью микроскопии TIRF.
Запрограммируйте микроскоп на сканирование на площади 400 на 50 изображений и разделение необработанных данных на отдельные файлы TIP, каждый из которых содержит максимум 10 000 изображений с помощью программы ImageJ. Сгладьте все изображения с помощью профиля освещения и используйте плагин MIST для сшивания изображений. Результат для характеристики биоконъюгации белка G ssDNA показал, что почти одно отношение белка G к ssDNA, где спектры буфера элюирования белка G малеимида и имидазола из ортогональной основы для подгонки к спектру продуктов биоконъюгации.
Нативный PAGE был использован для подтверждения биоконъюгации, показывающей ярко-зеленые полосы, совпадающие с мономерной полосой белка G, что указывает на успешную конъюгацию и хороший выход. Профиль освещения TIRF, введенный из одномодового волокна, как правило, ярче в середине поля зрения и тусклее по краям. Чтобы компенсировать неравномерное освещение и сгладить изображения для количественного анализа, профиль освещения определяли путем усреднения тысяч отдельных кадров.
Сглаженные изображения были получены путем вычитания шума камеры из профилей необработанного и освещения, а затем нормализации по профилю освещения. Необработанное сшивание показало четкие периодические узоры, соответствующие неисправленным изображениям, в то время как то же поле зрения, сшитое из сглаженных изображений, создавало плоский фон. Профиль нарастающего потока использовался для определения диапазона напряжения сдвига, приводящего к раскатке клеток и флуоресцентным дорожкам, под которыми можно было увидеть типичный след адгезии с одной ячейкой.
Показаны неоптимальные и оптимальные результаты флуоресцентных треков с недостаточной контрастностью, чрезмерной плотностью трека, оптимальной плотностью и контрастностью треков, а также дифракционной ограниченной и ДНК-PAINT визуализацией. время инкубации более 60 минут обеспечивает функционализацию поверхности, а правильная конструкция камеры предотвращает прохождение пузырьков, которые повреждают функционализированную поверхность. Эта процедура применима для количественного анализа молекулярной силы, участвующей в адгезии качения, и позволяет исследователям понять поведение качения различных типов клеток.
Этот метод позволяет исследователям исследовать новые вопросы, касающиеся событий быстрой адгезии, ведущих к дальнейшему продвижению исследований одной молекулы и механобиологии.
