Цифровое пространственное профилирование, или DSP, предлагает эффективный метод пространственно стратифицированной количественной оценки белка. Его реализация позволяет нам охарактеризовать экспрессию белка в различных областях опухоли и микроокружении. Ключевой особенностью DSP является возможность мультиплексирования, обеспечивающая высокую пропускную способность обработки данных.
Возможность определения настраиваемых областей, представляющих интерес, дополнительно обеспечивает пространственное измерение для анализа данных. DSP может быть применен к любому образцу, в котором пространственная количественная оценка белка или экспрессия РНК могут помочь прояснить патологический или физиологический процесс. Это особенно актуально в онкологии, где региональная вариабельность мишеней может коррелировать со злокачественным ростом или инвазией.
Продемонстрировать процедуру будут Скотт Палисул, гистотехнолог, и Рэйчел Барни, геномный технолог. Чтобы подготовить слайды, начните с того, что возьмите несколько двухмиллиметровых ядер из каждой биопсии и поместите их в один блок микрочипов ткани. Вырежьте четырехмикронные секции из блока и прикрепите их к стеклянным слайдам.
Поместите каждый слайд в прокладку держателя слайда и высиживайте его при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут. В полуавтоматической системе IHC заполните контейнер в положении один со 150 микролитрами буфера для стирки на слайд, плюс пять миллилитров мертвого объема и оставьте крышку открытой. Заполните такое же количество блокирующего раствора в контейнере во второй позиции.
Загрузите лоток контейнера с реагентами на машину. Выберите Обрабатывать IHC, а затем имя блокирующего решения в раскрывающемся списке поля Маркер. После завершения для всех слайдов нажмите кнопку Закрыть.
Затем нажмите «Печать этикеток», установите флажок «Все наклейки на слайдах», которые еще не напечатаны, и нажмите «Печать». Прикрепите метки к верхней части слайдов. Загрузите слайды в лоток для слайдов, убедившись, что образец и этикетка обращены вверх.
Нажмите светодиодную кнопку, чтобы опустить лоток, и позвольте инструменту начать сканирование и распознавание слайдов. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать эксперимент. Когда запуск будет завершен, нажмите светодиодную кнопку, когда она мигает зеленым цветом.
Снимите лоток с инструмента и осторожно поднимите крышку плитки с каждого слайда. Поместите слайды в 1X фосфатный буферизованный физиологический раствор. Удалите лишний буфер и очертите каждый участок ткани гидрофобной ручкой, чтобы создать гидрофобный барьер.
Сделайте раствор олиго антитела PC, добавив восемь микролитров каждого антитела на слайд и используя Buffer W для достижения конечного объема в 200 микролитров. Затем нанесите раствор олиго антитела PC на слайды и инкубируйте слайды в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации поместите горки в увлажненный лоток и трижды промойте в течение 10 минут в 1X TBST.
Постфиксируют в 4% параформальдегиде в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей промывкой дважды в течение пяти минут в 1X TBST. Добавьте ядерное пятно SYTO 13 в течение 15 минут при комнатной температуре, затем дважды промывьте 1X TBST. Наведите указатель мыши на Сбор данных в Центре управления и выберите Создать или Продолжить выполнение.
Поместите слайд в держатель слайда с меткой к пользователю. Опустите зажим скользящего лотка, следя за тем, чтобы ткань была видна в удлиненном окне. Добавьте шесть миллилитров Buffer S.Следуйте инструкциям в Центре управления.
Увеличьте масштаб между различными осями с помощью ползунков x и y, чтобы очертить область для сканирования. Выберите Сканировать и разрешите сканирование продолжаться до тех пор, пока не будет получена визуализирована вся определенная целевая область. Сгенерируйте 20-кратное изображение.
Определите рентабельность инвестиций, выбрав три круглых ROI одинакового размера диаметром 250 микрометров для каждого ядра ткани. Подтвердите окупаемость инвестиций, нажав кнопку Выход из рабочей области сканирования. Затем подождите, пока ультрафиолетовый свет расщепляет олиго от антител.
После завершения процесса очистки прибора выберите Сбор новых данных, чтобы продолжить работу с текущими слайдами или пластиной. Откройте оконченное окно пластины, дважды щелкнув область значка пластины. Введите номер партии пакета кода гибридизации и нажмите «Обновить».
Затем нажмите «Завершить». Отсоедините держатель слайда и пластину сбора, следуя инструкциям. Храните слайды в TBST или накройте их водной средой и накройте крышкой для длительного хранения.
Запечатайте пластины с помощью проницаемого уплотнения и высушите аспираты при 65 градусах Цельсия в термоциклере с открытым верхом. Добавьте семь микролитров воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем быстро раскрутить.
Подготовьте буферную смесь зонда, выбрав соответствующие уравнения R и U зонда, применяя уравнение, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 84 микролитра буферной смеси зонда в каждый пакет кода гибридизации. В свежей 96-луночной гибридизационной пластине добавьте восемь микролитров каждой основной смеси кода гибридизации во все 12 скважин указанного ряда.
Перенесите семь микролитров с коллекторной пластины DSP в соответствующую скважину в пластине гибридизации. Нагрейте уплотнение, раскрутите пластину и высиживайте ее в течение ночи при температуре 67 градусов по Цельсию. После инкубации охладите пластину на льду, и выполните быстрое вращение.
Объедините продукты гибридизации из каждой скважины в ленточную трубу, аккуратно пипетировав каждую скважину пять раз. Открутите вниз и загрузите ленточные трубки в систему анализа. На приборе DSP сохраните CDF-файл на USB-накопитель и передайте данные на цифровой анализатор.
На экране нажмите Начать обработку. Выберите Высокая чувствительность, а затем Далее. Нажмите Выбрать все для количества скважин с образцами, затем Готово, а затем Далее в уведомлении по электронной почте.
Затем нажмите кнопку Пуск. Как только подготовительная станция будет готова, запечатайте картридж и перенесите его на цифровой анализатор. Нажмите Начать подсчет.
Выберите Позиция сцены. Нажмите Загрузить существующий CDF-файл и выберите ранее загруженный файл. Нажмите Готово.
Снова выберите Положение рабочей области, нажмите Готово, а затем Пуск, чтобы запустить программу. Сохраните ZIP-файл файлов преобразования счетчика репортеров из системы анализа на USB-накопитель. Вставьте диск в устройство DSP.
В Центре управления DSP наведите указатель мыши на пункт Сбор данных и выберите команду Отправить учетные записи. Выберите соответствующий ZIP-файл. Щелкните Записи в Центре управления DSP.
Чтобы просмотреть проверки в очереди, выберите Добавить выбранные проверки в очередь, а затем Моя очередь анализа. Выберите Новое исследование из очереди, наведя указатель мыши на параметр Анализ данных в Центре управления. Эксперимент DSP проводился на образцах глиобластомы, и результаты визуализировались в виде тепловой карты.
Строки представляют белковые мишени, и каждый столбец соответствует интересующей области. Уровень выражения изображается цветовым диапазоном, варьирующимся от синего, показывающего низкую экспрессию, до красного, который обозначает высокое выражение. Изменчивость цвета в пределах ряда отражает региональную гетерогенность белка и предполагает возможную пространственную связь с дифференциальной экспрессией белка.
В этом эксперименте S100 и CD-56 были повсеместно высокими, потому что они являются нейронными маркерами. Маркеры с наибольшей вариабельностью включают B7-H3, KI-67, CD-44 и фибронектин, которые, как известно, связаны с пролиферацией опухоли, миграцией и метастазированием. Из широкого спектра целей-кандидатов DSP может идентифицировать те, которые демонстрируют значительные региональные различия.
Это закладывает основу для исследования факторов, связанных с изменчивостью и их отношением к заболеванию.
