Двухмерные клеточные культуры не адекватно имитируют рост опухоли in vivo. Для улучшения, 3D процедуры были разработаны с использованием сфероидов. Наш 3D глиобластома сфероид основе анализа особенно хорошо подходит для расследования вторжения опухоли головного мозга в здоровой среде опухоли головного мозга.
Трехмерные модели культуры могут быть использованы для повторения многоклеточной архитектуры, неоднородности и метаболического состояния опухолей, позволяющих более тщательную оценку воздействия наркотиков. Будьте уверены, чтобы не коснуться нижней части хорошо или полностью удалить супернатант, чтобы держать гель на льду, и добавить клетки в гель быстро. Для генерации равномерного размера опухолевых сфероидов, сначала мыть опухолевых клеток культуры интереса с пятью миллилитров PBS и лечения клеток с 0,5 до одного миллилитра диссоциации фермента.
После пяти минут при 37 градусах по Цельсию, остановить реакцию с четырьмя до 4,5 миллилитров PBS и передачи отдельных клеток в 15 миллилитров конической трубки, содержащей 10 миллилитров полного роста среды. После подсчета, повторного использования клеток в один раз от 10 до шестой клетки на восемь миллилитров полного роста среды дополняется двумя миллилитров 2%метилцеллюлозы концентрации и передачи суспензии в стерильный контейнер системы. Затем добавьте 100 микролитров клеток в каждую колодец 96-хорошо круглой нижней пластины и поместите пластину в 37 градусов по Цельсию 5%углекислого газа инкубатор в течение трех-четырех дней.
Для выполнения анализа вторжения, когда опухолевые клетки сформировали равномерно размера сфероидов, передать каждую структуру клеток в 500 микролитер трубки и мыть сфероиды один раз с 200 микролитров PBS. После второй стирки тщательно перенесите сфероиды в 100 микролитров свежеприготовленной коллагеновой матрицы и добавьте каждую суспензию сфероида в центр каждого колодец плоской нижней 96-хорошо пластины. После 30-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию добавьте 100 микролитров полной среды роста поверх геля в каждую хорошо.
Не забудьте поместить все сфероиды в центре каждого хорошо для лучшего изображения вторжения опухолевых клеток. Для выполнения миграционного анализа, когда опухолевые клетки сформировали равномерного размера сфероидов, пальто шесть хорошо пластины с 0,2 миллиграмма на миллилитр Matrigel в среде роста в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации удалите Matrigel и добавьте два миллилитров полной среды роста к каждой хорошо.
Перенесите сфероиды из круглой нижней пластины в 50 микролитровых томов в отдельные скважины шести скважин и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день, пятно сфероидов с 10 нанограмм на миллилитр Hoechst в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию. Для получения изображений после вторжения или миграции анализа, поместите пластину на сцену Яркого поля конфокальный микроскоп оснащен видеокамерой и получить изображения в течение соответствующего экспериментального периода.
Чтобы проанализировать изображения в полуавтоматической манере, импортировать изображения на Фиджи и нажмите Плагины, Макрос, Интерактивный переводчик. Копировать и вставлять адаптированную фиолетовую петлю. Держите фиолетовые предложения и добавить зеленые предложения интерес по мере необходимости.
Затем, чтобы измерить область каждого сфероида, нажмите Анализ и измерения. Для измерения гипоксии в различных областях сферической структуры, углеродной ангидразы IX окрашивания могут быть использованы для определения гипоксической активности. В этом репрезентативном анализе, более углеродной ангидразы IX положительные клетки наблюдались в сфероидный центр.
Гипоксические клетки, расположенные в сфероидном ядре, как правило, более гликолитические, чем клетки, окружающие ядро. Митохондрии могут быть изображены с помощью электронной микроскопии для дальнейшего анализа. Диаметр сфероида напрямую коррелирует с плотностью клеток, которые составляют структуру 3D-клеток, и макросы Фиджи могут быть использованы для количественной оценки пролиферации, вторжения или миграции клеток внутри каждого сфероида или миграции клеток внутри каждого сфероида.
Увеличение сфероидного ядра отражает стимуляцию пролиферации клеток. При ингибировании комплекса I митохондриальной дыхательной цепи, подавляющее большинство производства АТФ в митохондриях скомпрометировано снижение пролиферации на 20% после 72 часов. Лечение хлорида водорода усиливает вторжение коллагена типа I в течение 24 часов, но уменьшает миграционную область сфероидов в 1,5 раза по сравнению с контролем необработанных сфероидов.
По оценке живой визуализации, сфероиды демонстрируют высокую внутреннюю динамику и быстро перемещаются. Размер сфероидов должен быть относительно однородным и следует позаботиться о том, чтобы манипулировать сфероидами к центру скважин для получения наилучших результатов визуализации. Этот метод может быть также использован для исследования пролиферации опухолевых клеток, миграции и смерти, а также выражения внеклеточной матрицы, клеточных рецепторов или внутриклеточных белков, представляющих интерес.
Сфероиды могут быть также инкапсулированы и эффект повышенного поверхностного напряжения клеток может быть исследован при удалении капсул.
