Этот протокол имеет важное значение, поскольку может быть использован для изучения присутствия биомаркера глиомы методом, который сохраняет 3D структуру опухолевых нейросфер. Основным преимуществом этого протокола является то, что морфология нейросфер поддерживается по сравнению с методом цитоскопина, при котором клетки подвергаются стрессовым манипуляциям и становятся сплющенными. Этот метод может быть применен к любым другим системам культуры тканей, в которых клетки культури в 3D и поддержание структуры имеет важное значение.
Для начала, культура опухолевых нейросфер или NS в колбе Т-25, пока клетки не будут стечены. Избрать опухоль NS в 15 миллилитров конической трубки. Impellet NS на 300 Gs в течение пяти минут.
После этого повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр 10%формалин и инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте пять миллилитров HBSS в повторно приостановленный NS. Impellet клетки, как описано ранее. Поместите трубку, содержащую гранулы, на лед.
Повторно приостанавливайте промытую гранулу NS в 500 микролитров двухпроцентной теплой жидкой агарозы. И смешать нежным пипетки или перемешивания. Поместите агарозу, встроенную NS, на лед до тех пор, пока агароза не полимеризируется.
Затем удалите кусок агарозы, держа NS. Поместите кусок агарозы в кассету для обработки тканей. Установите водяную баню до 42 градусов по Цельсию. И аккуратно вставьте лезвие в микротом.
Затем поместите парафиновый блок в микротом. С одной стороны, нажмите вниз на рычаг, который контролирует толщину каждой секции, расположенной на левой стороне машины. Нажмите рычаг на вторую остановку, чтобы установить микротом до толщины 30 микрометров.
Поверните грубое колесо руки, чтобы начать обрезку блока. После того, как поверхность образца почти подвергается, установите рычаг, который контролирует толщину до пяти или 10 микрометров. Прекратите обрезку, когда поверхность образца будет достигнута.
Заполните ледяную коробку со льдом и достаточно воды, чтобы защитить парафиновую глыму от прямого прикосновения к льду. Откажитесь от старого лезвия микротомы и вставьте новое для секциоровки. Высушите парафиновый блок марлей и поместите его на микротому.
Поверните грубое колесо руки, чтобы начать раздел парафина. Затем используйте влажную кисть для переноса парафиновой ленты на водяную баню 42 градуса по Цельсию. Используя кривую типсов, поместите типсы между двумя парафинами и аккуратно раздвигите секции.
Используйте влажную кисть, чтобы подтолкнуть разделенные разделы на положительно заряженные слайды адгезионого микроскопа. Во-первых, растопить парафин, инкубируя горки в металлической стойке при 60 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем депарафинировать слайды через инкубацию в регидратационном поезде при комнатной температуре в соответствии с текстовым протоколом.
Храните слайды в водопроводной воде, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. После этого инкубировать слайды в буфере цитрата при 125 градусах по Цельсию в течение 30 секунд и 90 градусов по Цельсию в течение 10 секунд. Дайте слайдам остыть перед полоскать их пять раз дистиллированной водой.
Затем инкубировать слайды при комнатной температуре в 0,3% перекиси водорода в течение 20 минут. Затем промойте горки в течение пяти минут, три раза в стиральном буфере с нежным возбуждением. Инкубировать слайды на ночь в увлажненной камере установлен на четыре градуса по Цельсию с разбавленным первичным антителом.
После этого трижды мыть горки в течение пяти минут с нежным возбуждением. Затем инкубировать слайды в разбавленных биотинилированных вторичных антител при комнатной температуре в течение часа. Вымойте горки три раза в течение пяти минут в стиральном буфере с нежным возбуждением.
Затем инкубировать горки в avidin-биотинилированных хрена пероксидазы комплекса при комнатной температуре в темноте в течение часа. Повторите стирку, как описано ранее. После этого инкубировать слайды с МАЗ перекиси перекиси субстрата брендов в течение двух-пяти минут при комнатной температуре.
Промыть горки водопроводной водой и окунуть слайды в раствор гематоксилина, чтобы противостоять им. Затем тщательно промойте горки в водопроводной воде, пока вода не прояснится. Обезвоживать слайды в соответствии с текстовым протоколом.
Наконец, крышки слайдов с ксиленом основе монтажа среды и позволяют им высохнуть на плоской поверхности при комнатной температуре. В этом протоколе NS фиксируются и встраиваются в агарозу и парафин. И тогда они окрашены для конкретных биомаркеров глиомы.
Уровень экспрессии ATRX, белка сопровождающего, который опосредует структуру хроматина, низок. Ki67, биомаркер пролиферации клеток, является положительным в глиоме NS. Наконец, NS также являются положительными для OLIG2, транскрипционный фактор, который является посредником олигодендроцитов дифференциации. Самое главное помнить, чтобы вновь приостановить клетки хорошо в теплой агарозы перед передачей на лед, чтобы обеспечить равномерное распределение нейросфер.
