Изготовление наночастиц с липидным покрытием с помощью метода быстрой инъекции обеспечивает стабильную систему доставки лекарств для лечения рака. Этот метод является простой, быстрой, масштабируемой и воспроизводимой техникой изготовления наночастиц, которая инкапсулирует гидрофобные препараты. Этот метод применим для изготовления диагностических и терапевтических наночастиц из гидрофобных материалов, которые могут быть эффективно использованы в нескольких заболеваниях.
Этот метод изготовления, наряду с DLS, может быть использован для изучения нуклеации и роста гидрофобных материалов, таких как липиды, белки и полимеры. Зная физические химические свойства вашего препарата вещество имеет решающее значение перед изготовлением наночастиц. Также обязательно используйте правильные концентрации липидов покрытия.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, чтобы показать простоту техники изготовления и показать успешную доставку препарата в качестве наночастиц в клетки. Меры предосторожности должны быть приняты при работе с хлороформом и формальдегидом, и работа под капотом дыма не требуется. Для начала, обойтись 2,4 миллилитров 250 микромолярной фалкариндиол фондовый раствор растворяется в 70% этанола в сцинтилляционный флакон.
Используя концентратор образца, испаряйте жидкую фракцию в течение примерно четырех часов, чтобы получить сухой фалькариндиол. Используя концентратор образца, доставайте газ по образцу при комнатной температуре, чтобы сконцентрировать образец. После того, как сушеные, добавить компоненты, показанные здесь, чтобы сцинтилляционный флакон в дым капот, убедившись, что для очистки шприца с хлороформом после добавления каждого компонента, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Затем немедленно закройте флаконы, содержащие липиды, чтобы растворитель не испарился и тем самым модифицировать концентрацию. Оберните флакон алюминиевой фольгой, чтобы защитить DiI от света и оставьте образец на ночь в десикаторе, чтобы испарять хлороформ. На следующий день растворите высушенный образец в абсолютном этаноле, чтобы сделать окончательный объем 1,2 миллилитров.
Это решение представляет собой органическую фазу. Возьмите стеклянный флакон на 12 миллилитров и заполните его девятью миллилитров очищенной воды. Затем добавьте магнитную блоху во флакон, содержащий девять миллилитров воды.
Поместите флакон на магнитный мешалка и перемешайте при 500 об/мин. Затем прикрепите один миллилитр стеклянный шприц к системе дозирования и медленно вытяните хлороформ в и из стеклянного шприца по крайней мере 10 раз. Каждый раз высовывьте хлороформ в свой сборщик отходов.
Очистка шприца хлороформом помогает избежать загрязнения. Теперь премьер шприц с этанолом. Priming заменяет старый растворитель, а также удаляет любые пузырьки воздуха.
Используя шприц, аспирировать один миллилитр органической фазы, и вставить шприц в стеклянный флакон до середины девяти миллилитров водяной марки. Поддерживайте его устойчивым в середине флакона, и вводить раствор на 833 микролитров в секунду, нажав кнопку дозирования на дозаторной системы. Это генерирует 10 микролитров 50 микромоляных липидов покрытием наночастиц фалкариндиола в 10% этанола.
Эта скорость впрыска была найдена для достижения лучших наночастиц с узким распределением размера частиц. При введении, важно, чтобы убедиться, что игла вставляется в центре, устойчивый и прямой. Сразу после инъекции снимите флакон с мешалки и перенесите образец в круглую нижнюю колбу на 50 миллилитров.
Атака колбы на роторный испаритель, и испаряется один миллилитр органического растворителя при комнатной температуре. Будьте осторожны, чтобы избежать избыточного образования пузыря. Перенесите подвеску наночастиц из колбы в еще 12 миллилитров стеклянного флакона.
Убедитесь, что объем составляет девять миллилитров, а затем разделить образец на два 12 миллилитров стеклянных флаконов. Затем добавьте 0,5 миллилитров ультра чистой воды в один из флаконов и 0,5 миллилитра 10X фосфата буферного солевого раствора в другом флаконе. Включите цифровой прибор рассеяния света и установите нужную температуру до 20 градусов по Цельсию, пока она не стабилизируется.
Затем установите параметры инструмента, как показано здесь. Заполните пластиковый кюветт одним миллилитром наночастицы подвески, и начать измерение. Сообщите о измеренном размере в зависимости от используемого растворителя.
Семя примерно 50 000 клеток на стерильных 1,5 крышки скользит помещены в шесть хорошо пластины для получения плотности клеток примерно 30%Затем добавить культуры среды для того, чтобы иметь окончательный объем из трех миллилитров в каждой хорошо. Инкубировать клетки в течение 24 часов в стандартных условиях культуры. На следующий день добавьте три микролитров раствора наночастиц для окончательной концентрации фалкариндиола в пять микромоляров.
Затем верните клетки в инкубатор на 24 часа. После 24 часов лечения, мыть клетки дважды с PBS, а затем исправить их в 4%формальдегид в течение 10 минут при комнатной температуре. После фиксации, пронизывают клетки с 0,1%Triton X-100 в течение 30 минут.
Затем мыть их дважды с PBS, и пятно их с 250 микролитров 300 наномолярных DAPI в течение пяти минут, защищенных от света. Поместите крышку скольжения на слайд с помощью капли PBS. Поверните к 150x субъективному, и перенесите скольжение к этапу широкоугольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного электронной умноженной камерой CCD.
Ячейки изображений с использованием канала GFP-LP. Кроме того, проверить поглощение наночастиц в клетки, принимая конфокальные микроскопии изображения с помощью 63x нефтяной цели с численной диафрагмой 1,4. Изображение DiI с использованием аргонового лазера на 514 нанометров и DAPI с использованием двух фотон-лазера на 780 нанометров.
Неокрашенные наночастицы фалкариндиола, образую которые образуются в воде и измеряются в PBS, показали высокую полидисперсность, при этом индекс PD составил 0,571. Это значение указывает на широкое и неуниформное распределение размеров частиц. В отличие от этого, липидные наночастицы фалкариндиола, изготовленные в этом видео, были 74,1 нанометров с индексом полидисперсности 0,182, что указывает на относительно монодисперсное и равномерное распределение размеров частиц.
В качестве первого наблюдения наночастиц внутри клеток, эпифлуоресценции микроскопии изображения были приобретены после 24 часов лечения. Наночастицы были визуализированы как белые, яркие точки, и можно предположить, что наночастицы были расположены внутри клеток, окружающих ядро. Чтобы убедиться, что фалькариндиол наночастицы вошли в клетки, конфокальные микроскопии была выполнена на клетках, а также.
Здесь показано большое количество наночастиц, разбросанных в цитоплазме в каждой клетке. Эти результаты показывают, что наночастицы действуют как стабильная система доставки лекарств для фалкариндиола. При попытке этой процедуры, важно, чтобы придать решение на правильной скорости впрыска, сохраняя посев устойчивый, в центре, чтобы обеспечить надлежащее смешивание.
Эта процедура может быть использована для любого гидрофобного препарата, чтобы сформулировать терапевтические наночастицы или для изображений агентов сформулировать диагностические наночастицы, которые могут быть использованы в различных условиях заболевания, таких как рак. Этот метод позволил проработать механизм, с помощью которого наночастицы подхврошяются клетками, а также визуализацию живых клеток и изучить противораковый эффект препарата.
