Интраоперационный анализ хирургического монитора по-прежнему является большой проблемой в операциях по резекции опухоли, поскольку он требует диагностического инструмента для точного и быстрого подтверждения сложного иссечения раковой ткани. Тогда можно избежать повторных операций из-за положительного хирургического запаса. Наша высокоскоростная ультрафиолетовая фотоакустическая микроскопия с открытым верхом может обеспечить помеченные гистологические изображения образцов тканей в течение 18 минут с областью визуализации пять на пять миллиметров квадратов, демонстрируя большой потенциал для интраоперационного хирургического анализа поля.
Демонстрировать процедуру будет Сюфэн Ли, аспирант последнего курса из моей лаборатории. Начните с настройки оптического освещения для микроскопической системы с помощью твердотельного лазера с диодной накачкой Q-switch с длиной волны 266 нанометров в качестве источника возбуждения. Установите две выпуклые линзы для расширения лазерного луча и поместите точечное отверстие близко к фокусной точке первой выпуклой линзы для пространственной фильтрации.
Используйте зеркало 1D-гальванометра для отражения лазерного луча вверх. С помощью объектива сфокусируйте лазерный луч на образце. Закрепите кольцеобразный сфокусированный UT с активной областью, обращенной вверх, в лабораторный резервуар для воды с оптически прозрачным окном внизу, покрытым тонким кварцевым покровным слипом, затем прикрепите резервуар для воды к двухосевой ручной ступени микроскопа, чтобы контролировать боковое положение UT. Когда это будет сделано, включите УФ-лазер и отрегулируйте положение UT, чтобы позволить лазерному лучу пройти через центр UT, затем выключите ультрафиолетовый лазер и заполните резервуар для воды деионизированной водой, чтобы полностью погрузить UT. Подключите выход UT к двум усилителям, чтобы получить общий коэффициент усиления 56 децибел, а затем подключите выход второго усилителя к карте сбора данных или DAQ, установленной в компьютере.
Затем прикрепите держатель образца к ручной ступени по оси Z, соединенной с xy-моторизованными ступенями, а затем поместите четыре куска двусторонней ленты, окружающие пустое отверстие держателя образца. Затем перейдите к выравниванию системы, прикрепив черную ленту к стеклянному слайду, а затем поместив стеклянную горку, чтобы закрыть отверстие держателя образца черной лентой, обращенной вниз. После нажатия стеклянного слайда на держатель образца опустите держатель образца, чтобы погрузить стеклянный слайд в воду.
Отсоедините кольцевой UT и усилители, затем подключите UT к импульсу/приемнику и выход импульса/приемника к осциллографу. Переведите импульс/приемник в режим импульсного эха с амплитудой импульса шесть и коэффициентом усиления в 20 децибел. После того, как параметры установлены, отрегулируйте z-положение держателя образца, определите положение акустической фокальной плоскости, где ультразвуковые сигналы максимальны.
Измените импульс/приемник в режим передачи перед установкой коэффициента усиления на 60 децибел, затем включите лазерный выход и отрегулируйте z-положение объектива, чтобы максимизировать фотоакустические или ПА-сигналы, измеренные осциллографом. Чтобы сделать генерируемый сигнал ПА симметричным и максимальным, отрегулируйте боковое положение кольцеобразного UT, а затем отрегулируйте z-положение держателя образца, чтобы максимизировать сигналы PA. Повторите настройки для z-положения объектива и держателя образца, чтобы оптимизировать симметрию и амплитуду сигналов PA.
Когда сигналы PA оптимизированы, запишите временную задержку или время, затрачиваемое волнами PA на достижение UT на осциллографе. Переместите держатель образца в различные положения черной ленты. Отрегулируйте плоскостность держателей образцов таким образом, чтобы сигналы ПА, генерируемые из каждого положения черной ленты, имели ту же временную задержку, что и измеренные ранее.
После завершения выравнивания системы выключите лазер и подключите UT к двум усилителям. Чтобы приготовить срез мозга мыши с фиксацией формалина и парафином, зафиксируйте собранный мозг в 10% нейтральном буферизованном формалине. Через 24 часа обрабатывают неподвижный мозг путем обезвоживания градуированным спиртом, очистки ксилолом и встраивания парафином.
Используйте микротом, чтобы получить срезы встроенного мозга толщиной пять микрометров. Поместите ломтики образца на кварцевые горки для высыхания в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа. Позже депарафинизируют участки мозга очищающим агентом, чтобы избежать высоких фоновых сигналов парафина.
Чтобы приготовить свежий кусочек мозга мыши, промыть собранный мозг мыши PBS, а затем вручную вырезать кусочек образца мозга толщиной пять миллиметров, а затем промыть срез мозга PBS, чтобы удалить кровь на поперечном сечении. Для размещения образца подготовьте лабораторный резервуар для образцов с прозрачной полиэтиленовой мембраной толщиной 10 микрометров, затем добавьте каплю воды на мембрану и поместите биологический образец на резервуар для образцов, чтобы покрыть воду. Затем поместите резервуар, содержащий образец, на держатель образца, обеспечивая покрытие пустого отверстия держателя образца.
Установите УФ-лазер в режим внешнего триггера и используйте созданную лабораторией программу лабораторного просмотра для установки параметров сканирования, как описано в рукописи. Начните пробное сканирование на небольшой области, установив количество движущихся шагов двигателей по осям x и Y, затем отрегулируйте ручную ступень по оси Z, чтобы поместить образец на фокальную плоскость для получения максимальных сигналов PA. После перемещения двигателей по осям x и Y в нужную начальную точку и установки области сканирования путем установки значений xn и yn запустите программу получения изображения.
Когда изображения потребуются, выключите лазер и извлеките держатель образца. Храните свежие биологические ткани в 10% нейтральном буферизованном формалине. Используйте собранные сигналы ПА для реконструкции максимального амплитудного проекционного изображения с помощью лабораторного алгоритма обработки изображений.
Репрезентативный анализ показывает изображения UV-PAM и H&E среза мозга мыши FFPE. На увеличенном UV-PAM изображении отдельные ядра клеток могут быть разрешены. Соответствующие клеточные ядра были обнаружены на стандартных изображениях, окрашенных H&E, демонстрируя высокую точность текущей системы для клеточной визуализации.
Алгоритм глубокого обучения был применен для передачи изображения UV-PAM в оттенке серого в виртуальное окрашенное изображение H&E. Важно отрегулировать положение кольцеобразного ультразвукового преобразователя, чтобы ультрафиолетовый свет проходил через центр во время выравнивания системы. Это гарантирует, что обнаруживаемый фотоакустический сигнал может быть получен и дополнительно оптимизирован при включении лазера.
Наш алгоритм классификации может быть дополнительно включен для классификации опухоли и нормальных областей на изображениях, выступая в качестве вспомогательной визуализации и диагностической платформы для медицинских работников.
