Этот метод использует зеленые кофейные фрукты для проверки токсичности инсектицидов против кофейной ягоды. Применение инсектицида выполняется до или после заражения насекомыми для изучения репеллентности смертности насекомых и других эффектов. Использование настоящего зеленого кофе с питательными веществами, достаточными для роста насекомых, является наиболее подходящим способом оценки токсичности соединений для насекомых в смоделированных природных условиях.
Протокол позволяет оценить токсическое воздействие химических инсектицидов и на патогены, такие как грибы или репеллентные вещества. Это заражение фруктов и насекомых является критическим шагом, так как неправильная дезинфекция может привести к гибели насекомых из-за загрязнения. Качество насекомых также важно, так как слабые насекомые будут переоценивать результаты токсичного продукта.
Визуальная демонстрация позволяет выявить соответствующую стадию плодов процесса заражения насекомыми, соответствующий момент для распространения токсического вещества. И способ препарирования плодов. Продемонстрировать процедуру будет Клаудия Мартинес, научный сотрудник лаборатории.
Для начала соберите плоды зеленого кофе рано утром с приблизительным возрастом развития от 120 до 150 дней после цветения с кофейных плантаций. Выберите около 300 однородных и здоровых фруктов и выведите цветоносы. Опустите плоды зеленого кофе в 2% мыльный раствор и тщательно очистите, втирая их.
Затем трижды промойте плоды чистой водой. Погрузите их в 0,5% раствор гипохлорита натрия и поместите на шейкер на 10 минут со скоростью 110 оборотов в минуту. Трижды промойте фрукты чистой водой и высушите их стерильными бумажными полотенцами.
Облучайте плоды, помещая их на расстоянии 55 сантиметров от источника ультрафиолета в течение 15 минут внутри горизонтальной ламинарной проточной станции с УФ-контролем. Перемещайте плоды через каждые пять минут, чтобы обеспечить правильное облучение всего плода. Чтобы настроить биоанализы, погрузите появившиеся в тот же день кофейные ягоды в 0,5% раствор гипохлорита натрия и медленно перемешайте их щеткой в течение 10 минут.
Процедите этих насекомых через муслиновую ткань и трижды вымойте их стерильной дистиллированной водой. Удалите лишнюю воду стерильными бумажными полотенцами. Подготовьте группу из 30 плодов зеленого кофе на экспериментальную единицу и поместите их в пластиковую коробку.
Применяют различные концентрации исследуемого продукта для оценки с помощью портативного опрыскивателя, здесь использовались 5% и 6% алкалоидные эмульсии. В качестве контроля опрыскивайте группу плодов зеленого кофе водой. Используйте не менее трех экспериментальных установок для каждой обработки, распыляя одну за другой.
В стерильной вытяжке выпустите двух взрослых кофейных ягод на зеленый кофейный плод и накройте коробки через 30 минут. Оставьте пластиковые коробки с зараженными зелеными кофейными плодами в темноте внутри комнаты или инкубатора, имея контролируемые условия. Через 1, 7, 15 и 21 день подсчитайте количество плодов буры и живых и мертвых насекомых вне плодов в каждой коробке.
Через 20 дней после заражения рассекайте каждый плод зеленого кофе под стереомикроскопом с 10-кратным увеличением и подсчитайте количество здоровых семян или семян, поврежденных насекомыми в каждом плоде. Подсчитайте различные биологические стадии кофейной ягоды. Наблюдайте за количеством мертвых насекомых в каждом семени, чтобы определить смертность насекомых на экспериментальную единицу.
В стерильной вытяжке выпустите кофейные ягоды к ранее продезинфицированным зеленым кофейным плодам в соотношении два к одному и позвольте заражению продолжаться в течение трех часов при 21 градусе Цельсия. Большинство плодов зеленого кофе должны быть заражены через три часа, а брюшко кофейной ягоды все еще обнажается. Выберите 46 зараженных фруктов и поместите их в пластиковую стойку на 96 лунок, чтобы обработку можно было непосредственно распылить на бур кофейных ягод, перфорирующий фрукты.
Распылите три стойки не менее трех раз для обработки, одну за другой и накройте стойки через 30 минут. Через 20 дней рассекните плоды зеленого кофе под стереомикроскопом при 10-кратном увеличении и подсчитайте количество здоровых семян или семян, поврежденных насекомыми в каждом плоде. Подсчитайте различные биологические стадии кофейных ягод и количество мертвых насекомых в каждом семени, чтобы определить смертность насекомых на экспериментальную единицу.
Следуйте начальным шагам для оценки продукта с защитным эффектом на фрукты и выпустите зеленые кофейные плоды взрослых в пластиковые коробки. Затем подсчитайте количество кофейных ягод, которые вылетают из коробок, и количество, которое заражает зеленые кофейные плоды. После инкубации, в контролируемых условиях, с последующим рассечением через 20 дней после заражения и подсчетом семян и мертвых насекомых, следуйте шагам, намеченным для оценки продукта, после заражения кофейными ягодами.
Подсчитайте количество кофейных ягод, которые вышли из плодов зеленого кофе или улетели от плодов. После опрыскивания каждой обработки выполните шаги от инкубации в контролируемых условиях, чтобы определить смертность насекомых на экспериментальную единицу. 5% и 6% инсектицидов, примененных к кофейной ягоде, вызвали высокую смертность насекомых на 20-й день и показали значительные различия по сравнению с контролем.
Было замечено, что применение второго инсектицида привело к 94% здоровых семян, а инсектицидного одного - к 89% здоровых семян. 37% семян не были заражены в контрольной группе. В случае пост-заражения продукты проникали в кутикулу насекомых, вызывая гибель насекомых.
Самая высокая смертность произошла с двумя инсектицидами. Воздействие инсектицидов было отражено в процентном соотношении здоровых неинфицированных семян на 20-й день оценки. Уменьшенная популяция насекомых была обнаружена внутри семян кофе по сравнению с популяцией насекомых, обнаруженной в контрольной группе, опрыскиваемой водой.
Комбинированное действие энтомопатогена и репеллента приводило к минимальному повреждению семян и максимальной гибели насекомых. Это заражение плодов и дезинфекция насекомых обеспечивают протокольный успех. Эта методология также может быть использована для оценки толерантности или устойчивости кофейных плодов к кофейному ягодному буру.
Отрицательный эффект может наблюдаться и в отношении популяции насекомых в случае устойчивых к насекомым семян кофе. Данная методика может быть использована не только в энтомологии для оценки инсектицидов с различными способами действия, но и в селекции растений для оценки толерантных сортов и патологии растений для изучения взаимодействия плодов/патогенов.
