Двухфункциональная стратегия хроматографии иммобилизованного металла титана может обогатить как N-гликопептиды, так и фосфопептиды в одном и том же рабочем процессе, увеличивая биомолекулярную информацию из одного и того же анализа. Основным преимуществом этого обогащения являются два механизма разделения, которые позволяют одновременно разделять N-гликопептиды и фосфопептиды в отдельные фракции для последующего масс-спектрометрического анализа. Использование этого метода обогащения может улучшить обнаружение гликозилирования и фосфорилирования в сложных биологических образцах, таких как ткани поджелудочной железы, для обнаружения биомаркеров заболеваний, таких как диабет и рак.
Поскольку этот метод основан на спиновых наконечниках и центрифугировании, важно контролировать скорость центрифугирования и убедиться, что образцы не содержат частиц, чтобы предотвратить засорение. Для начала предварительно охладите части тканевого измельчителя, которые будут контактировать с тканями поджелудочной железы, а именно камеру, измельчитель и восстановительную ложку, вместе с любыми шпателями, в полистирольном контейнере. Затем переложите кусочки ткани в предварительно охлажденный держатель для образцов и добавьте жидкий азот в ткань, пока они не будут заморожены.
После помещения измельчителя в камеру нанесите на него удар молотком пять-десять раз, чтобы раздавить образец, затем извлеките измельчитель из камеры и соскоблите прилипший тканевый порошок и кусочки. Затем добавьте ложку жидкого азота в камеру, если ткани начнут плавиться, и повторите процесс измельчения до получения мелкого порошка и разделите образцы примерно на 100-миллиграммовые аликвоты в предварительно охлажденные пробирки. После приготовления буфера лизиса растворить по одной таблетке протеазы и ингибитора фосфатазы в 500 микролитрах воды, для запаса в 20 раз больше желаемой конечной концентрации, и добавить необходимый объем запаса каждого ингибитора в буфер лизиса для достижения конечных концентраций ингибитора.
После добавления 600 микролитров лизисного буфера в трубку, инкубируйте при 95 градусах Цельсия в нагревательном блоке в течение 10 минут с встряхиванием при 800 об/мин, затем извлеките образцы из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры. Затем обрабатывайте образцы ультразвуком при энергии 60 Вт в течение 45 секунд, используя 15-секундные импульсы с 30-секундным отдыхом между ними, и гранулируйте образцы в 3000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Добавьте супернатант в пять раз превышающий его объем осаждения растворителем.
Например, 300 микролитров буфера лизиса на 1,5 миллилитра растворителя осаждения, содержащего 50% ацетона, 49,9% этанола и 0,1% уксусной кислоты, затем охлаждают ночью при 80 градусах Цельсия. Снова гранулируют образцы в 3000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и удаляют супернатант, затем промывают гранулу, разбивая шпателем, и смешивают с тем же количеством растворителя для осаждения. После центрифугирования на воздухе высушите гранулу образца в вытяжном шкафу в течение 15 минут и храните при температуре 80 градусов Цельсия до готовности к продолжению.
Во-первых, повторно суспендируйте белковую гранулу в 300 микролитрах свежесваренного буфера пищеварения, содержащего 50 миллимолярных триэтиламмоний бикарбонатных буферов и восемь молярных мочевин. К белку в растворе добавляют дитиотрейтол до конечной концентрации пяти миллимоляров, перемешивают и уменьшают при комнатной температуре в течение одного часа, затем добавляют йодоацетамид до конечной концентрации в 15 миллимоляров. Перемешать и алкилат при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
Затем добавьте Lys-C/ трипсин в соотношении фермента к белку от 1 до 100 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в инкубаторе в течение четырех часов, затем добавьте 50 миллимолярного триэтиламмонийбикарбонатного буфера, чтобы разбавить восьмимоляную молярный мочевину, используемую до менее чем одного моляра. После добавления трипсина в соотношении фермент/белок от 1 до 100 инкубируют при 37 градусах Цельсия в инкубаторе на ночь, впоследствии гасят пищеварение добавлением трифторуксусной кислоты. На каждый миллиграмм исходного белка обусловите обессоливающий картридж с одним миллилитом ацетонитрила и трижды с одним миллилитром 0,1% трифторуксусной кислоты, затем загрузите переваренную смесь на обессоливающий картридж и трижды промыть смесь, используя один миллилитр 0,1% трифторуксусной кислоты.
Затем элюируют пептиды с использованием одного миллилитра 60% ацетонитрила и 0,1% раствора муравьиной кислоты, затем сушат элюированные пептиды при температуре примерно 35 градусов Цельсия с использованием центробежного вакуумного концентратора до полного испарения растворителя. После повторной приостановки пептидов в воде оцените концентрации пептидов с помощью пептидного анализа в соответствии с протоколом производителя, затем разделите пептиды на 500-микрограммовые аликвоты и полностью высушите. Взвесьте примерно три миллиграмма ваты и упакуйте ее в пустой отжимной наконечник.
После переноса одного грамма иммобилизованного металлического аффинного хроматографического материала титана в трубку добавляют 0,1% трифторуксусной кислоты к известной концентрации материала. После добавления достаточного количества суспензии в спин-наконечник для переноса 20 миллиграммов материала, промыть спин-наконечник центрифугированием 200 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты. Повторно приостановите образцы в 200 микролитрах загрузочного/промывочного растворителя и протейте через отжимной наконечник.
После промывки отжимного наконечника центрифугированием загрузочным/промывочным растворителем промыть отжимной наконечник 200 микролитрами 80%-го ацетонитрила 0,1 раствора муравьиной кислоты, затем элюировать пептиды 200 микролитрами Е1 и Е2 и анализировать каждое элюирование отдельно. Повторите процесс элюирования с использованием растворителей E3 и E4 и объедините соответствующие фракции элюирования перед последующим анализом. Перед выполнением элюирования при основном рН трижды обусловите материал, используя 200 микролитров 90% ацетонитрила в 2,5% гидроксида аммония, затем элюируйте пептиды 200 микролитрами растворителей E5 и E6 и анализируйте эти элюации отдельно после обессоливания с использованием упакованного наконечника.
Далее элюируют пептиды 200 микролитрами различных концентраций ацетонитрила и гидроксида аммония. После этого объедините эти элюи и проанализируйте как один образец, E7, после обессоливания с использованием упакованного наконечника. Аннотированные высоковероятные спектры MS/MS из N-гликозилированных и фосфорилированных пептидов были получены с богатой фрагментацией прекурсоров, что повысило уверенность в идентификации, назначенной программным обеспечением для поиска в базе данных.
Идентификация пептидов была обнаружена из образцов, обогащенных с использованием метода спинового наконечника с двойным функциональным титановым иммобилизованным металлическим сродством металлов по каждой фракции элюирования. Большинство гликопептидов элюируются в первых четырех фракциях, в то время как большинство фосфопептидов элюируются в последних трех фракциях, уменьшая потенциальные помехи в ионизации. Результаты гликопротеомики из метода двойного титана сравнивали с обогащением только Эрлихом-гликопептидом, демонстрируя, что пропорции каждого типа гликана после бинирования в шесть категорий, основанных на их составах, сходны между обоими способами.
Результаты фосфопротеомики по методу двойного титана сравнивали с обычной иммобилизованной металлической аффинной хроматографией только фосфопептидного обогащения или с использованием обоих методов. Большинство фосфорилированных аминокислот были идентифицированы как серин и треонин, с около 1% фосфорилированного тирозина. Правильная конструкция отжима наконечника важна для обеспечения плавного элюирования.
Плотно вставьте хлопок в наконечник, чтобы обогащающий материал можно было упаковать поверх хлопка. Мы использовали двухфункциональный титановый метод IMAC для одновременной характеристики гликозилирования и фосфорилирования в большинстве тканей и спайкового белка SARS-CoV-2.
