Повышенный уровень холестерина является основным фактором риска сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Наши протоколы предоставляют ценные инструменты для изучения как физиологических, так и механистических последствий гиперхолестеринемии. Эти процедуры могут быть выполнены с использованием базового лабораторного оборудования, и применимы к клеткам, тканям и ксенопус яйцеклеток.
Холестерин является основным компонентом клеточных мембран по всему телу. Эти методы могут быть использованы для изучения влияния повышенного уровня холестерина в любом типе клеток. Рассечение артерий является самым трудным шагом.
Тщательно удалите артерию из мозга, не растягивая и не повреждая сосудистую ткань. Липиды очень деликатны, и работа с ними - это скорее искусство, чем наука. Видео демонстрация предоставляет руководство для обучения, как обращаться с липидами тщательно.
Чтобы подготовить насыщенный холестерином метил-бета-циклодекстрин раствор, сначала добавьте 064 грамма метил-бета-циклодекстрина в 10 миллилитров PBS, перемешивая раствор с помощью батончика, чтобы убедиться, что метил-бета-циклодекстрин полностью растворяется. Затем добавьте 0024 грамма холестеринового порошка в колбу и энергично перемешивайте раствор, используя шпатель, чтобы разбить как можно больше кусков холестерина. Когда почти весь холестерин был растворен, запечатать колбу, по крайней мере два слоя парафиновой пленки.
И встряхните колбу около 30 колебаний в минуту в 37 градусов по Цельсию водяной бане на ночь. Через 8-16 часов охладите раствор до комнатной температуры, прежде чем фильтровать смесь через 22-метровый фильтр для шприца полиэтилена в классную бутылку. Для обогащения мозговой артерии млекопитающих, урожай мозга от 250 до 300 грамм Sprague Dawley крысы в стакан PBS на льду, прежде чем передать мозг в вощеной чаши вскрытия, под рассечением микроскопа, содержащий достаточно PBS, чтобы погрузить ткани.
Защитите мозг двумя-тремя булавками, убедившись, что они не проникают в кровеносные сосуды. И использовать острые миппы и небольшие хирургические ножницы, чтобы аккуратно вскрыть мозговые артерии и их ветви, которые образуют Круг Уиллиса у основания мозга. Далее, кратко промыть до одного сантиметра длиной артерии сегментов в PBS, прежде чем инкубации промыть сегментов в достаточно холестерина обогащающий раствор для покрытия тканей.
Чтобы определить любые изменения в уровне холестерина, используйте свежую бутылку филипинового порошка, чтобы подготовить 10 миллиграмм на миллилитр раствора запаса красителя в диметиловом сульфоксиде, и мыть холестерин обогащенных тканей с тремя пять минут моет в свежем PBS. После последней стирки, исправить сегменты артерии в 4%paraformaldehyde в течение 15 минут на льду, защищенный от света, прежде чем проницать образцы в 5%Triton в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть ткани с тремя пятью минутами моет в PBS на шейкер, прежде чем добавить образцы 25 микрограмм на миллилитр окончательной концентрации раствора филипина красителя, в течение одного часа при комнатной температуре, защищены от света.
В конце инкубации, мыть кусочки артерии в три раза, как попродемонстрировано, а затем краткое полоскание дистиллированной водой. После последнего мытья, использовать лабораторные ткани, чтобы поглотить излишки жидкости, и смонтировать артерии на слайде с помощью соответствующей среды монтажа. Тщательно накройте артерии крышкой скольжения, заботясь, чтобы избежать прокатки или скручивания ткани, и пусть слайд сухой в течение 24 часов при комнатной температуре, защищены от света.
Когда монтаж среды сухой, печать крышки скольжения края с четким лаком для ногтей, и дайте польский высохнуть в течение 10 до 15 минут. Затем, изображение ткани с возбуждением от 340 до 380 нанометров, и выброс от 385 до 470 нанометров. Для подготовки дисперсии на основе фосфата, объединить 200 микролитров 10 миллиграмм на миллилитр хлороформ растворенного липидного раствора, L-альфа-фосфатилетаноламин, 1-Palmitoyl-2-олеойл-sn-glycero-3-фосфатохолин, и холестерин в 12 миллилитров стеклянной трубки.
Испарите хлороформ в капюшоне под потоком азота, прежде чем приостановить липиды в 800 микролитров буферных 150 миллимолярный хлорид калия и 10 миллимолярный Tris HEPES раствор. Затем запечатайте трубку парафиновой пленкой и аккуратно опечатайте содержимое трубки на 80 килогерц в течение 10 минут, пока не образуется молочная смесь. Для обогащения холестерина ксенопусных яйцеклеток, использовать острые миппы, чтобы нарушить яичников мешок от самки xenopus laevis лягушки в нескольких регионах, и место яичников куски в 60 миллиметров пластины с пятью миллилитров кальция бесплатно ND96 дополнены 5 миллиграммов на миллилитр коллагеназы.
Встряхните ткань на орбитальном шейкере при 60 колебаниях в минуту в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации используйте переносную пипетку с широким наконечником, чтобы энергично пипетку яйцеклетки, содержащую раствор, пять-десять раз изолировать отдельные яйцеклетки, и быстро промыть темный раствор яйцеклетки свежим кальцием ND96 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Далее, передача 90 микролитров холестерина обогащенного фосфолипида на основе дисперсии в один колодец из 96 пластины хорошо, и добавить до шести яйцеклеток в колодец с как можно меньше среды, как это возможно.
Поместите пластину 96 хорошо на трехмерный ротатор платформы в течение пяти-десяти минут. Затем добавьте каплю ND96 в колодец и перенесите обогащенные холестерином яйцеклетки в 35-миллиметровую пластину, содержащую ND96 для их немедленного анализа. Здесь, пример изображенной мозговой артерии гладкий мышечный слой демонстрирует концентрацию зависимого увеличения филипина связанных флуоресценции, полученные при обогащении тканей с увеличением концентрации холестерина.
Примечательно, что через три часа после лечения метил-бета-циклодекстрином холестерина уровень холестерина снизился примерно на 50% по сравнению с их уровнем сразу после обогащения. В то время как один час инкубации время обычно используется для обогащения тканей и клеток с холестерином во время этого подхода, пять минут инкубации, как правило, достаточно для достижения статистически значимого увеличения содержания артериального холестерина в мозге, как это определено холестерина оксидазы на основе биохимического анализа. Хотя никаких существенных изменений наблюдается в уровнях холестерина в Ксенопс ооцитов обогащенный контроля фосфолипида основе дисперсий не хватает холестерина, уровень холестерина значительно повыситься только после пяти минут лечения с фосфолипид основе дисперсий, которые включают холестерин, и остаются на этом уровне, когда инкубацио время увеличивается до 60 минут.
Эффективность циклодекстринного подхода для обогащения клеток также демонстрируется в нейронах, недавно изолированных от области CA1 гиппокампа. Действительно, инкубация нейронов в метил-бета-циклодекстрин насыщенных холестерином в течение 60 минут приводит к более чем в два раза повышение уровня холестерина, по оценке филипина связанных флуоресценции. В целом, два наиболее важных шага для этих процедур являются подготовка смеси обогащения холестерина и обеспечения целостности артериальной ткани.
После обогащения холестерина, можно изучить функцию белков, которые страдают от гиперхолестеринемии. Способность обогащать клетки холестерином способствовала изучению повышенного уровня холестерина в кардиомиоцитах и нейронах. Использование ооцитов позволило нам исследовать, как холестерин связывается с ионные каналы.
Лабораторное пальто и перчатки, которые она всегда носила для этого протокола. Хлороформ и параформальдегид следует использовать под дымовой капот и выбрасывать в качестве опасных отходов.
