Ранее использовавшиеся модели in vitro или ex vivo не имеют компонентов кожных клеток и сложности тканей кожи. Этот анализ ex situ SCAD преодолевает установленное ограничение и позволяет изучать развитие рубцов за пределами раненого животного. Анализ SCAD позволяет визуализировать миграцию фибробластов и образование рубцов в микроокружении кожи.
Это позволяет скрининговым библиотекам активаторов или ингибиторов понять механистическую основу образования рубцов. Высокопроизводительные скрининговые анализы плоских библиотек с использованием модели SCAD для понимания фундаментального процесса и курса молекул, участвующих в заживлении ран. Анализ SCAD легко выполнить с использованием эксплантов кожи.
Для сплошного рубца рекомендуется выбирать послеродовой день нулевого дня или день первого дня кожи. Пожертвовав послеродовым щенком нулевого дня или первого дня новорожденного, используйте стерильный хирургический скальпель, чтобы аккуратно иссечь 1,5 на 1,5 сантиметра полной толщины спинной кожи до слоя скелетных мышц. Очистите кожу с помощью стерильных изогнутых щипцов, гарантируя, что поверхностная фасция неповреждена с нижележащей мышцей panniculus carnosus.
Промыть иссеченную ткань от 50 до 100 миллилитров холодной среды DMEM F-12 для удаления загрязняющей крови. Затем промыть ткань сбалансированным солевым раствором Хэнкса для поддержания жизнеспособности тканей и клеток. Поместите кожу вверх ногами с поверхностной фасцией сверху в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую среду DMEM F-12.
Затем, используя одноразовый двухмиллиметровый биопсийный перфоратор, иссечь круглые кусочки кожи полной толщины для создания срезанных тканей, гарантируя, что поверхностная фасция неповреждена с подлежащей мышцей panniculus carnosus до эпидермиса. Добавьте 200 микролитров свежей полной среды DMEM F-12 без фенольного красного цвета в каждую лунку 96-луночной пластины. Используя стерильные щипцы, переносите и полностью погружайте отдельные потертые ткани вверх ногами в колодцы 96-луночной плиты.
Перенесите пластину в инкубатор клеточной культуры, поддерживаемый в стандартных условиях. На второй и четвертый дни культуры удалите среду, оставив 10 микролитров в лунке, и добавьте свежую предварительно нагретую полную среду DMEM F-12 вместе с обработанными соединениями для поддержания жизнеспособности клеток и тканей. Для визуализации SCAD в реальном времени приготовьте 30 миллилитров 2-3% низкоплавкого раствора агарозы в PBS в стеклянной бутылке путем нагревания в микроволновой печи.
После кипячения сразу же переложить флакон и охладить жидкий раствор агарозы на водяной бане с температурой 40 градусов Цельсия. Затем перенесите ткань SCAD с фасцией или рубцом, обращенным вверх, на центр 35-миллиметровой тарелки. Затем вставьте SCAD при комнатной температуре, медленно наливая 40-градусную жидкую агарозу на ткань с помощью 1000-микролитрового наконечника пипетки.
Агароза полимеризуется в течение двух минут. После полимеризации добавляют два миллилитра предварительно нагретой готовой среды DMEM F-12. Затем, используя конфокальный или многофотонный микроскоп, оснащенный подходящими инкубационными системами, описанными в рукописи, получите покадровые изображения с нуля до первого дня.
Для сбора тканей промывайте ткани в соответствующие моменты времени, заменяя среду стерильным PBS. Используя стерильные щипцы, перенесите каждый SCAD в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 500 микролитров 2% параформальдегида, чтобы зафиксировать ткани на ночь при четырех градусах Цельсия. На следующий день промыть ткани три раза PBS, прежде чем приступить к двухмерному или трехмерному иммунофлуоресцентному окрашиванию, как описано в текстовой рукописи.
Здесь показаны репрезентативные изображения яркого поля SCAD в нулевой и пятый дни. Трихромное окрашивание вертикальных участков тканей Массоном выявляет признаки рубцевания тканей, сокращения тканей и накопления внеклеточного матрикса в ядре рубца в нулевой и пятый дни. Показано иммунофлуоресцентное окрашивание SCAD в нулевой и пятый дни.
Начиная с ранней и поздней стадии рубца, укоренившийся положительный фибробласт показан зеленым цветом, а укоренившийся отрицательный фибробласт красным. Для трехмерной визуализации ткани были встроены в раствор агарозы и покрыты PBSGT. Репрезентативные изображения демонстрируют эксклюзивную локализацию белка N-кадгерина в месте рубца SCAD пятого дня.
Трехмерная установка замедленной визуализации, оснащенная инкубационной камерой, отображала ранние события прогрессирования роев фибробластов в течение первых 12 часов или ранних стадий развития рубца. Здесь представлено графическое представление одноклеточных отслеживаемых клеточных траекторий отдельных фибробластов над развитием рубцов. Крайне важно поместить ткань SCAD вверх ногами внутри пластины колодца, чтобы фасция была обращена вверх.
Неспособность сделать это приведет к неизбежным изменениям в моделях миграции. Эта процедура позволяет исследовать кожные слои для лечения или культивирования с использованием химических модуляторов, нейтрализующих антител или вирусных методов. Это помогает в оценке патологических фиброзных реакций в различных медицинских учреждениях.
Мы показали экспрессию коннексина-43 и N-кадгерина в качестве ключевых молекул, участвующих в мобилизации фасций при ранении. Методология SCAD позволяет идентифицировать новые терапевтические стратегии для сокращения рубцевания и фиброза.
