В этой статье мы представляем оптимизированный протокол ран кожи человека ex vivo, который может предоставить важные данные об эффективности в рамках клинического трансляционного конвейера. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет высокопроизводительно точно оценить заживение ран в живой коже человека. Продемонстрировать процедуру будут Элизабет Робертс, постдокторант-исследователь, и Александрия Кидд, научный сотрудник нашей лаборатории.
Чтобы подготовить образец кожной ткани к ране, поместите дерму кожи стороной вниз в 90-миллиметровую чашку Петри и используйте стерильные ножницы для удаления жировой ткани. Когда весь жир будет удален, поместите кожу в 25 миллилитров HBSS, дополненных антибиотиками, в течение 10 минут при комнатной температуре с прерывистым встряхиванием, чтобы удалить любую остаточную кровь в жировой ткани. Через 10 минут промойте кожу в 25 миллилитрах DPBS.
Через 10 минут повторите полоскание HBSS без антибиотиков, а затем выполните окончательное полоскание в 25 миллилитрах DPBS. Затем поместите стерильную нейлоновую фильтрующей мембрану на блок абсорбирующей прокладки и высушите кожную сторону кожи на стерильной марле в 90-миллиметровой чашке Петри, чтобы удалить остаточные DPBS. Поместите высушенную кожу дермы стороной вниз на чистую 90-миллиметровую крышку чашки Петри, чтобы удалить остатки DPBS и смазать эпидермис свежей стерильной марлей.
Чтобы создать рану, прижмите двухмиллиметровый биопсийный удар к коже, удерживая кожу плотно и осторожно скручивая. Используя изогнутые зубчатые тканевые щипцы, подберите каждую сторону раны диаметром примерно два миллиметра и зацепить изогнутые ножницы Ириса под рану. Используйте шестимиллиметровый биопсийный пунш для биопсии вокруг центральной двухмиллиметровой раны, чтобы создать шестимиллиметровую эксплант с частичной толщиной два миллиметра раны в центре.
Затем поместите раневой эксплант эпидермиса стороной вверх на стек нейлоновой фильтрующей мембраны для одно-семидневной инкубации при 32-37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Для флуоресцентного окрашивания соберите раневые экспланты в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, содержащие 500 микролитров фиксатора кожи на трубку, и высиживьте экспланты на ночь при четырех градусах Цельсия. На следующий день замените фиксатор на один миллилитр окрашивания промывного буфера.
После промывки накройте каждый образец примерно 150 микролитрами блокирующего буфера и инкубируем в течение одного часа при комнатной температуре. После удаления блокирующего буфера добавьте 150 микролитров первичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере на трубку, и инкубируйте раневые экспланты на ночь при четырех градусах Цельсия. На следующее утро промойте образцы 500 микролитрами окрашивающего буфера для стирки, содержащего 0,2% азида натрия, а затем три полоскания в обычном буфере для стирки.
После промывки добавьте в каждую лунку 150 микролитров соответствующего флуоресцентно-конъюгированного вторичного антитела, разведенного в окрашивательном буфере для промывки для одночасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации промойте эксплант три раза в течение 30 минут в 500 микролитрах окрашивающего буфера для стирки на одну стирку, прежде чем противокрасить каждый эксплант 150 микролитрами DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, вымойте эксплант два раза в течение 30 минут с 500 микролитрами моечного буфера за одну стирку.
Для эксплантной визуализации поместите 60-миллиметровую чашку Петри на платформу визуализации конфокального микроскопа и добавьте примерно один миллилитровый слой DPBS в тарелку. Используйте щипцы для переноса раневых эксплантов на блюдо. После настройки программного обеспечения для визуализации в соответствии с экспериментом, расположите рану в центре плоскости визуализации и получите изображения биопсии раны.
Для выполнения беспроводной цифровой микроскопической визуализации для получения высококачественных изображений экономически эффективным способом подключите телефон или ноутбук к беспроводному цифровому микроскопу. Поместите экспланты, намотаные стороной вверх, на кусок лабораторной ткани и удалите из образца любой остаточный буфер промывки. Затем расположите эксплант в центре поля зрения микроскопа и получите изображения с помощью подключенной камеры.
Иммунопероксидаза и иммунофлуоресценция могут быть использованы для окрашивания целых тканей mount. Кроме того, живое/ мертвое окрашивание может быть выполнено на свежих тканях и изображено до или после фиксации. Окрашивание ран целым креплением может быть использовано для определения скорости закрытия раны воспроизводимым способом.
В этом репрезентативном анализе здоровое закрытие раны кожи наблюдалось через четыре-пять дней, в то время как диабетические раны кожи не смогли полностью закрыться в течение семидневного периода анализа. Экспрессия K14 достигла пика на второй день в здоровых ранах кожи, прежде чем быстро снизиться с увеличением эпидермальной дифференцировки. Эта реэпителизация и последующая эпидермальная дифференцировка были задержаны в диабетических ранах кожи.
Реформирование раннего эпидермального барьера исключает проникновение антителА К14 в дифференцированные эпидермальные слои. В начале процесса реэпителизации кератиноциты K14 с положительным базальным слоем мигрируют внутрь над открытой раной, так что эпидермис ближе к внешнему краю раны образуется раньше, чем эпидермис ближе к внутреннему краю раны. Позже на этапе восстановления окрашивание K14 теряется, поскольку эпидермис дифференцируется от внешней внутрь.
Окрашивание всего крепления также может быть использовано для изучения экспрессии и локализации других раневых соответствующих маркеров в коже, а также наличия иммунных клеток, представляющих интерес на участке раны на разных стадиях заживления. Создание воспроизводимых эксцизирующих ран может быть сложной задачей на первых порах. Мы бы посоветовали практиковать процедуру накрутки ран с использованием излишков кожи.
