В этой статье описан простой метод анализа ран в трехмерной, многоклеточной системе моделей культуры органов. Мы делаем это с помощью свиных глаз, но даже если вы не знакомы с глазами, вы можете сделать это анализ. В качестве обзора мы получили свиные глаза, вырезали глобусы, сделали круглую рану в роговице, которая проходит через эпителий и около трети стромы.
Мы вырезали роговицу, и смонтировать его на базе Агар, и положить эту конструкцию в инкубатор. Ткань будет заполнить в создании шрама в роговице. Вам не нужно добавлять какие-либо факторы роста, или даже сыворотки.
Это делается в безотхо сыворотки средств массовой информации. Хотя это выполняется в роговице, он может быть использован в качестве модели системы для фиброзного заживления в целом. Как и многие из клеточных путей, которые активируются во время рубцов похожи между системами.
В биобезопасности капот, использовать прямой край хирургического лезвия, чтобы удалить глобус из крышки на этанол очищенной разделочной доске, и удалить избыток жировой ткани с каждого глаза. Холдинг очищенный глобус задним силами сразу же окунуть глаз в PBS следуют три быстрых провалов в 10%йода, и два быстрых провалов в PBS. Затем оберните глаз окружно с чистой лабораторной ткани, чтобы обернуть с достаточным давлением для достижения тугой поверхности роговицы, не контактировать с роговицей.
Используя шестимиллиметровый трефин, проникайте в эпителий в передней строме в центре роговицы, не делая полной толщины раны через всю роговицу, и поверните трефин 180 градусов по часовой стрелке и против часовой стрелки пять раз, применяя легкое давление, чтобы углубить рану. Когда рана достаточно глубока, чтобы позволить лоскут ткани быть подняты с типсами, использовать хирургическое лезвие, чтобы сократить лоскут параллельно земному шару, продолжая поднимать переднюю роговицу в пределах раны края. Когда весь лоскут был удален, круговая рана должна быть расположена в центре роговицы.
Для сбора роговицы схватить глаз с лабораторной ткани, и использовать хирургическое лезвие, чтобы сделать небольшой разрез один миллиметр от края роговицы, чтобы включить лимбус и ткани сбора. Использование небольших, острых ножниц продолжать разрез по всему миру, сохраняя миллиметровый запас по всей роговицы, чтобы сохранить лимбус в такт. Затем поместите роговицу, раневую сторону вниз, в 60 миллиметров, или 100-миллиметровую тарелку, содержащую один миллилитр PBS.
Чтобы смонтировать роговицу, используйте две пары типсов, чтобы держать эпителиальную сторону роговицы вверх, чтобы создать чашку, и используйте стерильную трубу передачи, чтобы добавить разогретый раствор агара в роговицу, пока чашка не будет заполнена. После того, как агар затвердеет, аккуратно поместите роговицу в новую 60-миллиметровую тарелку агар-стороны вниз и накройте тарелку крышкой. Затем добавьте четыре миллилитров дополненной сыворотки свободной среды к каждой пластине роговицы поддержания роговицы на воздухо-жидком интерфейсе на лимбальной границе в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа, и смачивания поверхностей роговицы один раз в день с одной каплей дополненной сыворотки свободной среды от обусловленной среды в блюде, чтобы сохранить ткани гидратированных.
Для нокдауна гена смешайте пять микролитров малых помех или siRNa с 50 микролитров уменьшенной сыворотки минимальной необходимой среды и двумя микролитров трансфектного реагента. С 50 микролитров уменьшенной среды сыворотки на роговицу. Через пять минут смешайте две смеси вместе и добавьте 200 микролитров уменьшенной минимальной среды сыворотки к каждой смеси siRNA.
Затем пипетка siRNA решения падение мудрым на каждую рану. Затем поместите роговицы в инкубатор. Через три часа используйте среду в каждом блюде, чтобы вымыть siRNA с поверхностей роговицы, и заменить кондиционированную среду в каждом блюде со свежей дополненной сыворотки свободной среде плюс антибиотики.
Затем верните культуры роговицы в инкубатор клеточной культуры и инкубировать в течение двух недель. Через шесть часов после ранения эпителий роговицы отсутствует. Через шесть дней после ранения эпителий отрается.
Флуоресценция аминокислоты окрашивания с альфа гладкой мышцы актин показывает градиент активных миофибробластов вдоль раны края от передней до задней стромы. Иммуно-гистохимическое окрашивание для альфа-гладкого мышечного актина показывает резкое увеличение экспрессии белка альфа-гладкой мышцы актина у раненых плюс контрольные роговицы siRNA. По сравнению с раскручиваемой и целевой белка siRNA лечение, раненые роговицы.
Аналогичным образом, фибронектин дополнительный домен регулируется в siRNA лечение раненых роговицы по сравнению с раскручивается и целевой белка siRNA лечение раненых роговицы. Демонстрация успешного сбить целевого белка. Кроме того, лечение раненых роговиц с токсином, который неспецифически цели целевой белок предотвращает повторное эпителиализацию и приводит к качественной гибели клеток, дезорганизованной матрицы, и стромальные вакуолы предполагая, что токсин не способствует заживлению в концентрации анализа.
В заключение, при попытке этой процедуры важно помнить, чтобы сохранить лезвие параллельно ткани при резке, так что он не проникает в земной шар. Различные методы раны могут быть использованы с этим анализом, в том числе химический ожог или эпителиальный царапины. Он также может быть использован для анализа токсичности наркотиков, чтобы определить, если эпителий заживает и с какой скоростью.
Это экономия средств ex vivo, орган культуры модель системы, которая может предшествовать вашей in vivo раны исцеления исследований.
