3D-печатный держатель, используемый в этом протоколе, позволяет нам отслеживать кратковременную передачу сигналов клеток и долгосрочные события клеточной миграции в раненых роговицах в режиме реального времени. Сохраняя земной шар нетронутым, жизнеспособным и неподвижным, этот протокол создает высококачественные живые изображения клеток роговицы, включая эпителий и нервы. Держатель для 3D-печати можно легко модифицировать для глобусов различных размеров и видов.
Мы также можем ориентировать глаза по-разному, чтобы изображать другие области или проводить эксперименты с наноинденцией. Для начала, после удаления головки усыпленной мыши, поместите ее сразу на лед, чтобы сохранить жизнеспособность ткани. Затем энуклеируйте глобусы, подставляя его, используя пинцет.
И обрежьте зрительный нерв с помощью ножниц для рассечения чуть ниже, где он удерживается пинцетом. Инкубируйте глобусы в двух миллилитрах среды в чашке для культивирования клеток P-35, включая индикатор кальция и/или пятно клеточной мембраны в течение одного часа в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в условиях низкой освещенности, гарантируя, что глобусы погружены в среду для равномерного окрашивания. Чтобы приклеить держатели к чистой стеклянной нижней крышке, вымойте держатель в 70% этаноле и поместите клей на держатель.
Затем приклейте держатель к стеклянной нижней крышке, гарантируя, что клей не находится во внутренней области держателя, так как клей может флуоресцировать, усложняя визуализацию. После того, как клей затвердеет, убедитесь, что держатель надежно защищен от скольжения крышки. Удалите глобусы из окрашивающего раствора с помощью стерильных пипеток, позаботившись о предотвращении повреждения тканей интересующей области.
Промывайте глобусы в течение пяти минут при комнатной температуре, используя стерильный фосфатный буферизованный физиологический раствор, чтобы удалить лишние пятна и поместить глобусы в среду для транспортировки в микроскоп. Чтобы намотать глобусы с помощью стерильной иглы 25 калибра в интересующей области, поднимите и удерживайте глобус от задней части глаза, используя стерильную пипетку, чтобы сохранить земной шар стабильным и предотвратить его катание. Для царапины осторожно переместите стерильную иглу 25 калибра через открытую роговицу или осторожно вдавите иглу непосредственно в центральную роговицу для колотой раны, гарантируя, что рана не проткнет базальную мембрану роговицы.
Поместите роговицу или лимбальную область на крышку во внутренней области держателя, подтверждая, что глобус расположен правильно и что интересующее место находится в контакте со стеклянным покрытием. Стабилизировать с помощью 3D-печатной крышки, приклеенной к держателю, с помощью клея. И не пытайтесь удалить земной шар, так как это может вызвать повреждение тканей.
Включите микроскоп и установите камеру окружающей среды на 35 градусов цельсия и 5% углекислого газа и проверьте увлажненную камеру. Поместите держатель крышки и стабилизированный глобус на ступень микроскопа в камеру окружающей среды и изображение, используя методы визуализации живых клеток. С помощью ветеринара дополнительные питательные среды на крышке скольжения для предотвращения обезвоживания и поддержания жизнеспособности тканей, гарантируя, что в колодце достаточно среды, чтобы покрыть земной шар в держателе.
Начните эксперименты с использованием методов визуализации живых клеток, используя при этом маломощные лазерные установки для сохранения ткани и предотвращения повреждения тканей и соответствующих целей для длительных экспериментов. Запись и сохранение данных в предпочтительном формате файлов CZI для записи данных. Получены высококачественные данные визуализации многослойной структуры для роговицы X vivo, стабилизированной с помощью 3D-печатного держателя, демонстрирующего сигнальные события кальция в апикальном, базальном и стромальном слоях роговицы.
Были получены Z-стековые изображения роговицы, обездвиженной в 3D-печатном держателе, при царапине раны для визуализации клеточных мембран и передачи сигналов кальция во всех слоях роговицы и мобилизации кальция в разных Z-плоскостях. Эксперимент с временными рядами роговицы был выполнен для изучения клеточной миграции в раневое ложе во время реакции заживления, выявляя небольшое движение земного шара в направлениях X, Y или Z. Было отмечено, что, помещая глобус в держатель, можно визуализировать различные области роговицы, как в центральной, так и в лимбальной области роговицы.
Этот протокол позволяет нам получать изображения глаз из моделей заболеваний, которые демонстрируют различия в заживлении ран. Мы можем охарактеризовать аберрации в клеточной сигнализации и подвижность в живой ткани.
