Протокол предлагает простой метод очистки активных молекулярных двигателей с использованием системы бакуловируса Sf9. В нем также подробно описывается подвижность одной молекулы и многомоторные скользящие анализы для изучения регуляторного механизма моторных белков. Все это традиционное векторное выражение Sf9 baculovirus expression и одноступенчатая аффинная очистка приведут чистый и активный моторный белок к изучению механистических деталей сверхпроцессорных кинезинов в одномолекулярных и многомоторных системах.
В дополнение к двигателям Kinesin, протокол может быть применен для изучения биохимических и биофизических свойств других белков на основе цитоскелета, таких как дионин и миозин. Протокол подробный и простой в использовании. Некоторые предложения заключаются в том, чтобы осторожно обращаться с клетками Sf9, поскольку они подвержены загрязнению, и следовать примечаниям, приведенным в протоколе.
Визуальная демонстрация очень эффективна, проста в выполнении и понимании критических шагов, особенно для тех, кто никогда не выполнял эти анализы. Демонстрировать процедуру будут Пушпанджали Соппина и Дипешвари Шевале, аспиранты, работающие со мной и Прадипом Наиком. Для начала посейте клетки в 35-миллилитровую чашку, с плотностью от 4,5 раз 10 до пятой клетки на миллилитр.
Через 24 часа смешайте один микрограмм ДНК bacmid и 100 микролитров недополнимых носителей Грейс в трубке. Смешайте шесть микролитров трансфекционного реагента в другой трубке со 100 микролитрами недополнимой среды Грейс. Осторожно перенесите содержимое первой трубки во вторую.
Смешайте их и инкубируйте смесь в течение 45 минут при комнатной температуре. Добавьте в смесь 0,8 миллилитра недополняемых носителей Грейс. Смешайте и аспирируйте среду Sf900 SFM из клеток.
Добавьте приготовленную трансфекционную среду по каплям на верхнюю часть клеток и инкубируйте пластину в течение шести часов. Затем аккуратно удалить трансфекционную смесь. Добавьте два миллилитра среды SF900 SFM и инкубируйте далее при температуре 28 градусов Цельсия в течение 48 часов.
Затем проверьте экспрессию моторного белка под перевернутым флуоресцентным микроскопом. Соберите среду с инфицированными клетками и вращайтесь в течение пяти минут, при 500 г. Соберите супернатант и заморозьте аликвоты. Добавьте 10 миллилитров среды SF900 SFM с клетками и один миллилитр запаса вируса P-zero в стерильную коническую колбу объемом 100 миллилитров.
Инкубировать при 28 градусах Цельсия с постоянным встряхиванием при 90 об/мин. Через 72 часа вращайте клетки в 15-миллилитровой стерильной конической трубке при 500 г в течение пяти минут и соберите супернатант. Для крупномасштабной экспрессии белка заражают 30 миллилитров культуры суспензии одним миллилитром вирусов P1.
Через 72 часа после заражения проверьте клетки на экспрессию белка и соберите клетки в стерильные, 50 миллилитровых, конические трубки. После вращения отбросьте надосадочный материал и соберите ячейку гранулы. Чтобы лизировать клетки, добавьте три миллилитра буфера лизиса ледяного холода в гранулу клетки.
Вращайте лизат клетки при 150 000 г в течение 30 минут, при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант и смешайте его с 40 микролитрами 50%-ной аффинной смолы ANTI-FLAG M2. Инкубировать смесь при четырех градусах Цельсия в течение трех часов с сквозным кувырканием.
Теперь гранулируйте смолу FLAG, прядя при 500 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Трижды промыть гранулу смолы FLAG с помощью буфера холодной промывки со льдом. А после третьей стирки тщательно слейте промывочный буфер.
Затем добавьте 70 микролитров промывочного буфера, содержащего 100 микрограммов на миллилитр пептида FLAG, к смоляной грануле и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия, как показано ранее. После вращения соберите супернатант, содержащий очищенный белок, в свежую трубку. Приготовьте полимеризационную смесь, как описано в рукописи, и добавьте 10 микролитров тубулина в полимеризационную смесь.
Переложите трубку в тепловой блок, предварительно нагретый при 37 градусах Цельсия, и инкубируйте в течение 30 минут. После приготовления стабилизационного буфера микротрубочек разогрейте его и добавьте к полимеризованным микротрубочкам. После того, как камера проточной ячейки моторики подготовлена, пропустите 30 микролитров разбавленного раствора микротрубочек через камеру.
Через 30 минут протойте от 40 до 50 микролитров блокирующего буфера и высиживайте его. Приготовьте смесь для моторики и добавьте в нее один микролитр очищенного мотора. Хорошо перемешайте и перетейте раствор в камеру подвижности.
Запечатайте оба конца камеры подвижности и изображение под подсветкой TIRF. Сосредоточьтесь на отдельных двигателях, помеченных mCitirine, движущихся процессно. Смешайте меченый родамином тубулин с немаркированным тубулином в соотношении один к 10.
После 30 минут полимеризации аккуратно добавьте 30 микролитров предварительно разогретого стабилизационного буфера микротрубочек и инкубируйте далее, в течение пяти минут, при 37 градусах Цельсия. Срежьте микротрубочки путем пипетки капиллярным загрузочным наконечником. После подготовки камеры подвижности проточите 50 микролитров очищенных нанотел GFP Sf9 и инкубируйте в течение 30 минут.
Блокируйте поверхность скольжения крышки, пропуская 50 микролитров блочного буфера. Приготовьте 50 микролитров моторной смеси. Добавьте его в камеру после осторожного перемешивания раствора и инкубируйте в течение 30 минут.
Дважды промыть камеру 50 микролитрами Р12-казеина. Подготовьте скользящую пробирную смесь и аккуратно перемешайте ее, прежде чем влить в камеру подвижности. Запечатайте концы камеры подвижности и нанесите изображение микротрубочки, скользящей под подсветкой TIRF.
После 48 часов трансфекции нетрансфектные клетки кажутся маленькими, круглыми и прочно прикрепленными. Однако трансфектированные клетки, экспрессирующие белок, были слабо прикреплены к поверхности и показали увеличенный диаметр клеток. Через 72 часа более 90% клеток Sf9 экспрессировали флуоресцентно помеченные, кинезин-3 мотор KIF1A, и клетки были слабо связаны с поверхностью.
Моторный белок Кинезин-3 был очищен из трансфектированных клеток Sf9. Кимограф изображает моторную ходьбу кинезин-3 процессно, по поверхности микротрубочек. События подвижности показали среднюю скорость и длину пробега примерно 2,44 микрометра в секунду и 10,79 микрометра соответственно.
Кимограф показывает плавное скольжение микротрубочек двигателями кинезин-3 со средней скоростью около 1,37 микрометра в секунду. Самое главное – добавить стабилизационный буфер, не нарушая смесь микротрубочек и не срезать микротрубочку. Протокол будет полезен для других применений, таких как измерения АТФазы, биофизический анализ, механизмы, анализы восстановления in vitro и т.д.
Используя очищенные двигатели sf9, мы недавно продемонстрировали, что двигатели кинезин-3 быстры и сверхпроцессорны. Интересно, что эти двигатели демонстрируют высокие показатели оборота АТФ по сравнению с хорошо охарактеризованным двигателем, Кинезином-1.
