Protokol, Sf9 bakülovirüs sistemini kullanarak aktif moleküler motorları saflaştırmak için basit bir yöntem sunar. Ayrıca, motor proteinlerin düzenleyici mekanizmasını incelemek için tek moleküllü hareketlilik ve çok motorlu kayma testlerini de detaylandırır. Tüm bu geleneksel vektör ekspresyonu Sf9 bakülovirüs ekspresyonu ve tek adımlı afinite saflaştırması, saf ve aktif motor proteininin tek moleküllü ve çok motorlu sistemlerde Süperprosesif Kinesinlerin mekanik ayrıntılarını incelemesine yol açacaktır.
Kinesin motorlarına ek olarak, protokol, dionin ve miyozin gibi diğer sitoiskelet bazlı proteinlerin biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklerini incelemek için uygulanabilir. Protokol ayrıntılı ve takip edilmesi kolaydır. Bazı öneriler, Sf9 hücrelerini kontaminasyona eğilimli oldukları için dikkatli bir şekilde ele almak ve protokolde verilen notları takip etmektir.
Görsel gösterim, özellikle bu tahlilleri hiç yapmamış olanlar için kritik adımları takip etmek ve anlamak için oldukça etkilidir. Prosedürü gösterenler, benimle ve Pradeep Naik ile çalışan doktora öğrencileri olan Pushpanjali Soppina ve Dipeshwari Shewale olacak. Başlamak için, hücreleri 35 mililitrelik bir tabakta, mililitre başına 4.5 kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda tohumlayın.
24 saat sonra, bir mikrogram bacmid DNA ve 100 mikrolitre takviyesiz Grace'in ortamını bir tüpte karıştırın. Altı mikrolitre transfeksiyon reaktifini başka bir tüpte 100 mikrolitre takviyesiz Grace'in ortamı ile karıştırın. İlk tüpün içeriğini dikkatlice ikinci tüpe aktarın.
Onları karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Karışıma 0,8 mililitre takviyesiz Grace'in ortamını ekleyin. Sf900 SFM ortamını hücrelerden karıştırın ve aspire edin.
Hazırlanan transfeksiyon ortamını hücrelerin üstüne damla damla ekleyin ve plakayı altı saat boyunca inkübe edin. Ardından transfeksiyon karışımını dikkatlice çıkarın. İki mililitre SF900 SFM ortamı ekleyin ve 48 saat boyunca 28 santigrat derecede daha fazla inkübe edin.
Daha sonra, motor protein ekspresyonunu ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında kontrol edin. Medyayı enfekte olmuş hücrelerle toplayın ve 500 G.Süpernatantı toplayın ve alikotları dondurun beş dakika boyunca döndürün. Steril, 100 mililitrelik konik bir şişeye hücrelerle birlikte 10 mililitre SF900 SFM ortamı ve bir mililitre P-sıfır virüs stoğu ekleyin.
90 rpm'de sürekli sallanarak 28 santigrat derecede inkübe edin. 72 saat sonra, hücreleri 15 mililitrelik, steril bir konik tüpte 500 G'de beş dakika boyunca döndürün ve süpernatanı toplayın. Büyük ölçekli protein ekspresyonu için, süspansiyon kültürünün 30 mililitresini bir mililitre P1 stok virüsü ile enfekte edin.
Enfeksiyondan 72 saat sonra, hücreleri protein ekspresyonu açısından kontrol edin ve hücreleri steril, 50 mililitre, konik tüplerde toplayın. Eğirdikten sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini toplayın. Hücreleri lize etmek için, hücre peletine üç mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.
Hücre lizatını 30 dakika boyunca 150.000 G'de, dört santigrat derecede döndürün. Süpernatantı toplayın ve 40 mikrolitre% 50 ANTI-FLAG M2 afinite reçinesi ile karıştırın. Karışımı uçtan uca yuvarlanma ile üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Şimdi FLAG reçinesini dört santigrat derecede bir dakika boyunca 500 G'de döndürerek toplayın. FLAG reçine peletini buz gibi soğuk yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, yıkama tamponunu dikkatlice boşaltın.
Daha sonra, reçine peletine mililitre FLAG peptidi başına 100 mikrogram içeren 70 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Eğirdikten sonra, saflaştırılmış protein içeren süpernatantı taze bir tüp halinde toplayın. Makalede açıklandığı gibi bir polimerizasyon karışımı hazırlayın ve polimerizasyon karışımına 10 mikrolitre tübülin ekleyin.
Tüpü bir ısı bloğuna aktarın, 37 santigrat derecede önceden ısıtın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Mikrotübül stabilizasyon tamponunu hazırladıktan sonra, ısıtın ve polimerize mikrotübüllere ekleyin. Motiliteli akış hücresi odası hazırlandıktan sonra, odadan 30 mikrolitre seyreltilmiş mikrotübül çözeltisi akıtın.
30 dakika sonra, 40 ila 50 mikrolitre bloke edici tampon akıtın ve inkübe edin. Bir hareketlilik karışımı hazırlayın ve saflaştırılmış motorun bir mikrolitresini ekleyin. İyice karıştırın ve çözeltiyi hareketlilik odasına akıtın.
Hareketlilik odasının her iki ucunu ve görüntüyü TIRF aydınlatması altında kapatın. İşlemsel olarak hareket eden bireysel mCitirine etiketli motorlara odaklanın. Rodamin etiketli tübülini etiketsiz tübülinle bir ila 10 oranında karıştırın.
30 dakikalık polimerizasyondan sonra, hafifçe 30 mikrolitre önceden ısıtılmış mikrotübül stabilizasyon tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede daha fazla inkübe edin. Kılcal yükleme ucu ile pipetleme yaparak mikrotübülleri kesin. Motiliteli akış odasını hazırladıktan sonra, 50 mikrolitre Sf9 saflaştırılmış GFP nanocisimciklerini akıtın ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
50 mikrolitre blok tamponu akıtarak kapak kayma yüzeyini bloke edin. Motor karışımının 50 mikrolitresini hazırlayın. Çözeltiyi hafifçe karıştırdıktan sonra odaya akıtın ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
Odayı iki kez, 50 mikrolitre P12-kazein ile yıkayın. Kayan tahlil karışımını hazırlayın ve hareketlilik odasına akıtmadan önce yavaşça karıştırın. Hareket odasının uçlarını kapatın ve TIRF aydınlatması altında kayan mikrotübülleri görüntüleyin.
48 saatlik transfeksiyondan sonra, transfekte edilmemiş hücreler küçük, yuvarlak ve sıkıca tutturulmuş olarak görünür. Bununla birlikte, proteini eksprese eden transfekte hücreler, yüzeye gevşek bir şekilde bağlandı ve genişlemiş hücre çapı gösterdi. 72 saat sonra, Sf9 hücrelerinin% 90'ından fazlası floresan etiketli, kinesin-3 motor KIF1A'yı eksprese etti ve hücreler yüzeye gevşek bir şekilde bağlandı.
Kinesin-3 motor proteini, transfekte Sf9 hücrelerinden saflaştırıldı. Kimograf, kinesin-3 motorunu mikrotübül yüzeyi boyunca işlemsel olarak yürürken tasvir eder. Motilite olayları, sırasıyla saniyede yaklaşık 2.44 mikrometre ve 10.79 mikrometre ortalama hız ve çalışma uzunluğu göstermiştir.
Kimograf, kinesin-3 motorları tarafından saniyede ortalama 1.37 mikrometre hızla düzgün mikrotübül kaymasını gösterir. En önemli şey, mikrotübül karışımını bozmadan stabilizasyon tamponunu eklemek ve mikrotübülü kesmemektir. Protokol, ATPaz ölçümleri, biyofiziksel analiz, mekanizmalar, in vitro sulandırma testleri vb. gibi diğer uygulamalar için yararlı olacaktır.
Sf9 saflaştırılmış motorları kullanarak, yakın zamanda kinesin-3 motorlarının hızlı ve süper-işlemsel olduğunu gösterdik. İlginç bir şekilde, bu motorlar, iyi karakterize edilmiş motor Kinesin-1'e kıyasla yüksek ATP devir hızları sergilemektedir.
