Мы объединяем флуоресцентную микроскопию с микрофлюидикой, чтобы изучить, как актин-связывающие белки регулируют сборку и разборку актиновых нитей. С помощью микрофлюидики мы можем количественно оценивать реакции, происходящие на десятках отдельных актиновых нитей одновременно, точно контролируя биохимические и механические условия. Помните, что растворы сначала впрыскиваются параллельно, пока они не достигнут камеры, а затем нити последовательно подвергаются воздействию на каждый раствор путем изменения настройки давления.
Чтобы начать приготовление полидиметилсилоксана, или PDMS, камерной сборки, предварительно разогрейте конфорку до 100 градусов Цельсия. Подвергайте одну очищенную камеру PDMS и одну стеклянную крышку в чистой чашке Петри ультрафиолетовому свету в течение трех-пяти минут в глубоком УФ-очистителе. Когда это будет сделано, расположите камеру PDMS над скольжением крышки таким образом, чтобы две поверхности, непосредственно подверженные воздействию ультрафиолета, соприкасались.
Чтобы удалить пузырьки воздуха, застрявшие на проскальзывающем интерфейсе крышки PDMS, осторожно прижмите палец к поверхности камеры. Плотно прижмитесь к углам и сторонам, следя за тем, чтобы потолок камеры не соприкасался со стеклянной поверхностью. Поместите камеру со стеклянным дном лицом к конфорке при 100 градусах Цельсия на пять минут.
Затем немедленно используйте камеру или храните ее в чистой чашке Петри в течение недели. Чтобы промыть впускную и выходную трубку, заполните одну 2-миллилитровую резервуарную трубку 300 микролитрами F-буфера, прикрутите ее к микрофлюидному держателю и установите давление на 300 миллибар. Пусть пять-восемь капель F-буфера пойдут впустую, затем установите давление до нуля и повторите процедуру для каждого канала.
Затем установите давление для выходного отверстия на резервуарной трубке от четырех до 50 миллибар, как только капля выйдет из наконечника трубки, подключите трубку к выходу камеры PDMS. Когда жидкость заполняет камеру и выходит из всех входов, установите давление на выходе на 20 миллибар. Позже установите давление для резервуарной трубы на уровне от 1 до 50 миллибар.
Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, убедитесь, что капля выходит из трубки и входного отверстия PDMS, прежде чем подключать трубку к входной. Установите давление на входе в 30 миллибар. После соединения входных отверстий два и три, как показано, установите давление всех входов на 20 миллибар, а давление на выходе на нулевом миллибаре.
Убедитесь, что скорость потока во входных отверстиях примерно равна. При смене резервуара установите все давление на входе в 12 миллибар и давление на выходе на 5 миллибар. Чтобы быстро ввести раствор, установите давление соответствующего входного отверстия в 150 миллибар и отрегулируйте давление в других входах примерно до 100 миллибар, так что результирующая скорость потока во входных отверстиях составляет 500 нанолитров в минуту.
Чтобы изменить раствор, заполните от 200 до 300 микролитров раствора в новую резервуарную трубу и установите давление на изменение настройки. Затем открутите резервуарную трубу входного отверстия. После того, как на кончике трубки образовалась небольшая капля, вкрутите новую трубку со свежим раствором, измените настройку давления на высокий поток.
В зависимости от микрофлюидной конфигурации и геометрии камеры подождите от трех до пяти минут, пока раствор заполнит трубку и достигнет камеры. Процесс может сопровождаться измерением увеличения флуоресценции с течением времени. Для функционализации поверхности измените раствор от трех до 200 микролитров 50 пикомолярных спектрин-актиновых семян в F-буфере и вводят раствор в течение двух минут с высоким потоком три.
Для поверхностной пассивации замените третью трубку с 300 микролитрами 5% BSA в F-буфере, затем введите в течение пяти минут при высоком потоке три, затем пять минут в середине потока три, со сниженным давлением от семи до восьми миллибар в каналах один и два, чтобы получить противоток 100 нанолитров в минуту. Вся поверхность камеры будет пассивирована BSA. Замените третью трубку на F-буфер, чтобы промыть канал в течение пяти минут при высоком потоке три.
Позже замените трубки от одного до трех с одним микромолярным актином профилином, 0,15 микромолярным актином и буфером F соответственно, как объясняется в рукописи, и вводят свежеприготовленные растворы с использованием высокого потока, все предустановлено в течение трех-четырех минут. Включите микроскоп и отрегулируйте время экспозиции камеры до 100-200 миллисекунд, лазер возбуждения до 10-20% мощности и общую флуоресценцию внутреннего отражения, или глубину TIRF, на расстоянии от 200 до 300 нанометров для захвата изображений с объективом 60X. Затем установите установку давления на средний поток в течение 10 минут, чтобы записать полимеризацию нити накала со скоростью одного кадра каждые 20 секунд, а затем средний поток два в течение 15 минут для старения нити.
Захват деполимеризации в режиме эпифлуоресценции на одном кадре каждые пять секунд, после одного-двух кадров, переключается на средний поток три, чтобы записать деполимеризацию нитей со скоростью около 10 субъединиц в секунду. Чтобы сбросить эксперимент, разорвите все флуоресцентно меченые нити, непрерывно подвергая их воздействию лазера с максимальной мощностью в течение двух минут. Испытайте различные условия, заменив растворы один, два или три и впрыскивая их при высоком потоке в течение трех-четырех минут.
Здесь представлен результат основного эксперимента полимеризации/деполимеризации. Полученные кимографы использовались для количественной оценки скорости полимеризации и деполимеризации. Когда выращенные актиновые нити подвергались воздействию флуоресцентно меченого раствора кофилина, кластеры кофилина зарождались и росли к заостренным и колючим концам.
Когда одиночные нити подвергаются воздействию фасцина, они образуют пучки, которые кажутся более яркими и не идеально выровненными с потоком. Очень важно избегать введения пузырьков воздуха в систему при смене трубок и обращать внимание на то, чтобы резервуарные трубы не пустели. Этот метод имел решающее значение для применения силы притяжения к десяткам одиночных нитей, изучения механической чувствительности формина и кофилина и деветрации ARP2/3.
