Клеточные мембраны сильно переполнены из-за наличия встроенных белков и сахаров. Мы демонстрируем одномолекулярную визуализацию на синтетических переполненных липидных бислоях. Эта платформа полезна для исследования влияния скученности на мембранные биомолекулярные реакции на молекулярном уровне.
Протокол объясняет анализ связывания, диффузии и сборки мембранных биомолекул. Успех эксперимента зависит от тщательной очистки подложки, предотвращения повреждения бислоя и поддержания высокого отношения сигнал/шум при визуализации одной молекулы. Процедуру со мной демонстрируют Адитья Упасани и Вишвеш Харичаран Рай, аспиранты лаборатории.
Начните с размещения обработанного плазмой акрилового слайда на чистую папиросную бумагу. Отклейте двухстороннюю лазерную ленту и приклейте ее к слайду. Используя наконечник пипетки, сгладите ленту, чтобы предотвратить утечку из одного канала в другой.
Закройте камеру, поместив обработанную плазмой крышку на заклеенный слайд. Используя наконечник пипетки, осторожно прижмите крышку на проклеенные области, чтобы сделать канал водонепроницаемым. При использовании стеклянных слайдов запечатывают края с помощью эпоксидной смолы.
Храните подготовленные микрофлюидные камеры визуализации в течение одной-двух недель в высохших условиях. Возьмите стеклянный флакон, предварительно очищенный с использованием раствора пирании, и добавьте раствор хлороформа POPC и DOPE-PEG(2000) с желаемой мольной фракцией липидов PEG 2000, чтобы получить конечную концентрацию липидов в три миллимоляра, после добавления буфера. Аналогично могут быть приготовлены и другие мембранные композиции липидов.
Далее высушите хлороформ из флакона с помощью мягкой струи азота с небольшим вихрем, чтобы нужные липиды равномерно покрывались на поверхности флакона. Удалите остаточный хлороформ, храня флакон в вакуумном осушителе в течение одного часа. Затем добавьте один миллилитр PBS во флакон и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия.
После ночной инкубации осторожно вихрьте флакон в течение одной-двух минут, пока раствор не станет мутным и молочным. Теперь переложите 100 микролитров этого раствора в небольшую 500-микролитровую центрифужную трубку. Для получения небольших одноламеллярных пузырьков диаметром от 50 до 100 нанометров обрабатывают раствор ультразвуком в течение примерно одного часа в ванне с помощью ультразвукового аппарата.
В конце обработки ультразвуком раствор станет прозрачным, если раствор все еще мутный, затем обжарьте ультразвуком в течение дополнительных 30 минут. Затем добавляют хлорид кальция в обработанные ультразвуком везикулы до конечной концентрации 30 миллимоляров в растворе липидов. Вырежьте наконечник микропипетки, чтобы ввести образец раствора, чтобы он плотно поместился в отверстие.
Смешайте липидный раствор и введите его через одно из отверстий в камере визуализации. Протрите лишний раствор, который выходит из камеры из розетки, чистой тканью, чтобы предотвратить загрязнение соседних каналов. Подготовьте увлажняющую камеру, поместив влажную ткань на конец 50-миллилитровой центрифужной трубки.
Поместите затвор в трубку и закройте крышку трубки. Уложите трубку вбок и оставьте этот узел в увлажненной камере на 90 минут, желательно в инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Тщательно промывайте камеру обильным количеством буфера PBS, предотвращая попадание пузырьков воздуха в камеру во время промывки, так как это может привести к дефектам мембраны.
Перед проведением любого эксперимента по мобильности и сборке выровняйте микроскоп TIRF, подготовив образец флуоресцентного шарика и добавив их в микрофлюидный канал при низких концентрациях, чтобы флуоресцентные пятна от отдельных шариков не перекрывались на изображениях. Во-первых, визуализируйте бусины в режиме эпифлуоресценции. Пока освещение находится в режиме эпифлуоресценции, переместите зеркало M5, сидящее на сцене трансляции, так, чтобы луч, выходящий из объектива, изгибался до тех пор, пока не будет достигнута полная конфигурация внутреннего отражения.
Чтобы проверить, было ли достигнуто освещение МДП, убедитесь, что видны только бусины на поверхности, когда испаряющееся поле МДП освещает образец шарика и не наблюдаются свободно плавающие бусины вдали от поверхности. В начале эксперимента установите мощность лазера в задней фокальной плоскости объектива на уровне от пяти до 10 милливатт, чтобы предотвратить фоторазрушение флуорофоров. Держите слайд на ступени микроскопа и сначала сосредоточьтесь на голой мембране, для визуализации мембраны достаточно небольших следов примесей в липидных мембранах.
Введите образец с помощью микропипетки в камеру визуализации с покрытием PEG SLB. Для измерения кинетики связывания одной молекулы используйте шприцевой насос для протекания меченых биомолекул через входные отверстия в микрофлюидную камеру со скоростью потока от 50 до 500 микролитров в минуту. Чтобы записать 5 000 кадров со скоростью от 25 до 50 кадров в секунду, установите необходимые параметры получения видео.
Начните сбор пленки и приобретите более 5000 кадров под непрерывным потоком от шприцевого насоса до тех пор, пока не произойдет дальнейшего увеличения появления новых пятен на поверхности мембраны, и проанализируйте кинетику связывания, как описано в рукописи. Для отслеживания отдельных частиц добавьте меченые биомолекулы в низких концентрациях в канал с помощью микропипетки. Чтобы обеспечить высокую точность треков, извлеченных из наборов данных, оптимизируйте концентрацию до плотности менее 0,1 частицы на квадратный микрометр, чтобы отдельные частицы редко пересекались.
При необходимости инкубируйте камеру в увлажняющей среде и промывайте буфером перед визуализацией. Для анализа траектории одной частицы получите от 200 до 500 кадров со скоростью от 10 до 100 кадров в секунду и сохраните объектив, сфокусированный на двухслойной плоскости с минимальным дрейфом ступени во время получения изображения. Для измерения субъединиц добавляют соответствующую концентрацию меченых биомолекул в микрофлюидную камеру визуализации и инкубируют слайд в увлажняющей камере при желаемой температуре в течение требуемого времени.
Перед визуализацией промыть камеру визуализации буфером. Поместите слайд на микроскоп и отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать меченые молекулы. Установите мощность лазера на уровень, при котором отбеливание флуорофора происходит постепенно.
В идеале для каждого собранного комплекса контролируйте мощность лазера, чтобы поддерживать скорость шага отбеливания фотографий на расстоянии от 10 до 20 кадров друг от друга, как описано в рукописи, и получайте изображения до тех пор, пока все молекулы не будут полностью отбелены. Выполните зависящее от времени измерение сборки, начав сбор пленки, как только образец вводится в камеру, и приобретая новые пленки для отбеливания фотографий через фиксированные промежутки времени после связывания мембраны из разных сегментов PEG SLB. Связывание цитолизина А с липидными мембранами с пятимолевым процентом DOPE-PEG(2000) показало повышенную плотность частиц и достигло насыщения.
Экспоненциальная функция распада, подходящая к связанным частицам, дает константу времени для связывания цитолизина А с мембраной. Без какого-либо полимера ПЭГ в мембране большинство индикаторов демонстрировали ограниченную диффузию на SLB. Небольшие уровни ПЭГ 2000 в мембранном бислое поднимались от подстилающей поверхности, что позволяло молекулам индикатора диффундировать без поверхностных ограничений.
Однако экстремальное удержание наблюдается при высокой концентрации ПЭГ в двухслойной мембране. Распределение ISD2 для диффузии липофильного индикатора ДНК в двух различных липидных мембранах PEG 2000 показало снижение подвижности при высоких концентрациях ПЭГ. После инкубации на переполненной липидной двухслойной мембране цитолизин А демонстрировал множество различных этапов фотоотбеливания, предполагая образование различных промежуточных продуктов сборки.
После корректировки на эффективность маркировки окончательное распределение олигомеров показало додекамерный вид цитолизина А в качестве доминирующей структуры. Сборка мембранного связывания с белками и другие реакции должны проводиться в соответствующих средах мембранной скученности. Следует обратить внимание на очистку камеры визуализации, избегая разрушения бислоя и настройки микроскопа TIRF.
