Маркировка стволовых клеток и их потомства индуцируемой трансгенной линией, прослеживающей линию мыши, позволяет проводить пространственный и временной анализ активации, пролиферации, миграции и/или дифференцировки взрослых стволовых клеток в мозге in vivo. Отслеживание родословной может выявить новую информацию о приверженности линии, реакции на вмешательства и мультитенции. Преимущества подходов к трансгенному отслеживанию линий включают специфичность отслеживания конкретной клеточной линии, неизгладимую экспрессию флуоресцентного белка независимо от клеточного оборота или дифференцировки, низкую токсичность доксицилина, условную активацию и простоту использования с общими последующими анализами на прослеживающих тканях линии, включая иммуноокрашивание и иммунофлуоресценцию.
Из-за широкого значения пластичности и клеток во взрослом мозге, характеристика и анализ взрослых стволовых клеток помогут информировать об изучении нейродегенеративных заболеваний, метаболических воздействий на пластичность мозга, старения и других связанных с этим состояний. Для начала разогрейте горки до комнатной температуры и зафиксируйте ледяным холодным ацетоном в течение 15 минут. Мойте слайды в течение пяти минут в 1X ополаскивательном буфере, встряхивая со скоростью 60 оборотов в минуту при комнатной температуре между каждым шагом.
Пермеабилизируют для стояния ядерных антигенов с 0,3%Тритон Х-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Пермеабилизируют для стояния цитоплазматических антигенов с 0,3% Tween-20 в течение 10 минут при комнатной температуре. Выполняйте извлечение антигена с помощью микроволнистых слайдов в 50-100 миллилитрах 1x DAKO Antigen Retrieval Solution на низком уровне в течение 10 минут, дважды.
Далее смойте буфером в течение пяти минут при комнатной температуре. инкубировать слайды в 0,3% Typogen Black в 70% этаноле в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем промыть ополаскивателем. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг ткани.
Блокируйте на 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия блокирующим реагентом. И инкубировать с первичным антителом, разведенным в разбавитом антителе в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Мойте горки в течение 10 минут при комнатной температуре.
На следующий день инкубируют участки во вторичных антителах Alexa Fluor в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем дважды промывайте слайды в буфере для полоскания в течение 10 минут. Покрыть участки мозга 100 микролитрами от одного до 500 антител против GFP, конъюгированных с AlexaFluor 488, и инкубировать в течение ночи при четырех градусах Цельсия, чтобы повысить эндогенный Fluor4, отмечая прослеживаемые клетки.
На следующий день дважды помойте ополаскивателем. А затем промыть в проточной ВОДЕ в течение пяти минут. Противодействуйте 100 нанограммам на миллилитр 4'6-диамидино-2-фенилиндол в течение пяти минут.
Затем промыть в проточной DI воде в течение пяти минут. Добавьте каплю флуоресцентной безопасной монтажной среды поверх каждого участка ткани и запечатайте крышкой размером 22 на 22 миллиметра. Визуализация рекомендуется в день монтажа для обеспечения оптимального сигнала.
Начинать фиксацию и сечение после транскардиальной перфузии после фиксации мозга в 4% PFA за ночь при четырех градусах Цельсия. А затем снова в течение одного часа при комнатной температуре. Промывайте мозги в 1x PBS в течение часа дважды при комнатной температуре.
Разрежьте мозг на участки толщиной в один миллиметр с помощью сагиттального блока мозга и поместите в пять миллилитровых микроцентрифужных трубок, содержащих 1x PBS. Для предварительной обработки метанола начните с промывки 1x PBS в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Промыть в 50% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре.
Промыть в 80% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре. Промыть в 100% метаноле в течение одного часа, дважды, при комнатной температуре. Отбеливающие образцы с 5% перекисью водорода в 20% диметилсульфоксида и метанолом при четырех градусах Цельсия за ночь.
После отбеливания промыть образцы метанолом в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Промыть в 20% диметилсульфоксиде и метаноле в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Промыть в 80% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре.
Промыть в 50% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре. Мойте в PBS в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Стирайте в PBS 0,2%Triton X-100 в течение одного часа дважды при комнатной температуре.
Для иммуноокрашения очищающего мозга начните с инкубации образцов в 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 молярного глицина, при 37 градусах Цельсия в течение ночи на орбитальном шейкере. Блокируйте в 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% козьей сыворотке при 37 градусах Цельсия в течение трех дней на орбитальном шейкере. Промывайте образцы в 1x PBS, 0,2%Tween-20, 10 мкг на миллилитр гепариновой натриевой соли из слизистой оболочки свиней в течение одного часа дважды при 37 градусах Цельсия.
Далее инкубируют в 1x PBS, 0,2%Tween-20, 10 мкг на миллилитр гепарина, 5%DMSO, 3%козьей сыворотки, содержащей от одной до 500 концентраций анти-кролика против GFP AlexaFluor 488 при 37 градусах Цельсия на орбитальном шейкере в течение двух дней. Промывайте образцы в 1x PBS, 0,2% Tween-20 с 10 микрограммами на миллилитр гепарина в течение одного часа при 37 градусах Цельсия на орбитальном шейкере три раза, а затем один раз в день в течение двух дней. Инкубируйте образцы на ночь в одном миллилитре 50% тетрагидрофурана и воде.
Инкубируйте образцы в течение одного часа в одном миллилитре 80% ТГФ тетрагидрофурана и воды. Инкубируйте образцы дважды в течение одного часа в 100% тетрагидрофуране. Сушат образцы стерильной салфеткой и инкубируют в дихлорметане до тех пор, пока они не опустятся на дно флакона.
Не инкубируйте более 60 минут. Инкубируйте образцы в одном миллилитре дибензилового эфира до очистки. Храните образцы в дибензиловом эфире при комнатной температуре до готовности к изображению.
Чтобы получить изображение иммуноокрашенных участков мозга, проанализируйте слайды с помощью конфокальной микроскопии, где может быть подтверждена коэкспрессия нескольких антител. Мы используем пятимикроскоп Leica Stellaris с гибридными детекторами HyD S. Чтобы получить изображение очищенного мозга, используйте перевернутый конфокальный микроскоп с автоматизированной сценой и автоматизированной функцией укладки плитки.
Начните с того, что положите очищенный участок мозга плоско на стеклянную нижнюю чашку в погружение в дибензиловый эфир. Заметная разница в интенсивности флуоресценции в разных областях мозга и различных типах клеток наблюдалась после периода погони за пульсом в линии прослеживаемого мозга. Хориоидные эпителиальные клетки в сосудистом сплетении имели толстую клеточную мембрану и сильный зеленый флуоресцентный сигнал, указывающий на то, что они получены из трет-положительных клеток, которые легко отличимы от окружающих клеток.
Другие более мелкие типы клеток в строме сосудистого сплетения имели более слабый сигнал GFP. В мозжечке глиальные клетки Бергмана экспрессировали более высокие уровни GFP, чем клетки корзины, и вариации в экспрессии GFP также существовали между отдельными клетками корзины. Для заводских сенсорных нейронов аксоны в клубочковом слое обонятельной луковицы также экспрессировали высокие уровни GFP Обонятельные сенсорные нейронные аксоны, которые заполняют клубочковый слой обонятельной луковицы, выражали высокие уровни мембранного помидора или красную флуоресценцию по сравнению с большинством других областей мозга, даже когда те же нейроны являются положительными GFP, что указывает на то, что некоторые клетки, по-видимому, теряют сигнал mTomato медленнее во время трассировки линии.
Напротив, в сосудистом сплетении GFP положительные клетки экспрессируют низкий mTomato. В большинстве других областей мозга томатные сигналы экспрессируются на низком уровне в большинстве типов клеток, причем эндотелиальные клетки являются одними из единственных клеток, чей флуоресцентный сигнал был достаточно ярким, чтобы отчетливо выделяться на красном флуоресцентном фоне ткани мозга. Самое главное, что нужно помнить, это то, что флуоресцентный сигнал в очищенном мозге исчезает быстрее, чем большинство других иммунопробиров.
Не забудьте изобразить образцы как можно скорее и в течение семи дней. После этого визуализация срезов мозга или чистого мозга, окрашивание маркеров сигналами GFP и наша количественная оценка флуоренса могут быть предприняты с помощью программ.
