Углубленная характеристика электромобилей может быть сложной задачей, требующей нескольких инструментов для описания отдельных параметров. Измерение этих ключевых критериев в одном методе, таком как nano-Flow Cytometry, описывает несколько субпопуляций EV одновременно. Таким образом, каждый EV измеряется индивидуально, идентифицируя частицы диаметром более 14 нанометров без метки, прежде чем определять их флуоресценцию.
Это создает надежный набор данных, удаляя ложные срабатывания. Нанопоточная цитометрия может быть применена к электромобилям из различных источников, включая те, которые обогащены плазмой, ликвором и питательной средой. Этот метод также используется для анализа вирусов, липидных наночастиц и наноматериалов.
Важно оптимизировать протокол маркировки. Это максимизирует любую флуоресценцию, связанную с частицей, по сравнению с любой остаточной флуоресценцией, оставшейся в буфере. Для начала включите прибор, загрузите Nano-Flow Profession и выберите «Запустить вверх» в раскрывающемся меню «Поток оболочки», загрузите воду в загрузочный отсек и выберите «Ускорение» в раскрывающемся меню «Поток оболочки».
Разбавьте шарики контроля качества от одного до 100 в дистиллированной воде в 0,6-микролитровой трубке и поместите его в загрузочный отсек для введения образца в систему. Затем увеличьте образец в течение 45 секунд, как показано ранее, чтобы полностью заменить предыдущий образец, воду или чистящий раствор. Во время усиления установите мощность лазера на предустановленный шаблон для бусин QC на 250 нанометров FL QC стандарт.
Позже, чтобы уменьшить давление в системе, выберите давление отбора проб из того же раскрывающегося меню и установите автоматическое давление отбора проб на один килограмм паскаля для поддержания постоянного давления. Затем инициируйте одноминутный анализ, выбрав Время записи из элементов управления приобретением. Данные будут нанесены на точечный график, показывающий логарифмическую шкалу интенсивности бокового рассеяния и выбранную интенсивность флуоресценции.
Перед сохранением файла вставьте имя файла и образец разбавления. Затем выберите выгрузку, чтобы удалить трубу из загрузочного отсека. Замените шарики контроля качества 150 микролитрами чистящего раствора и очищайте в течение более 30 секунд, выбрав Boosting.
Используя трубку, содержащую 150 микролитров воды, удалите любой лишний чистящий раствор из капиллярного наконечника, окунув наконечник в воду. Затем разбавьте стандартные шарики размера от одного до 100 в воде и загрузите 100 микролитров в загрузочный отсек. Теперь установите мощность лазера на предустановленный шаблон S16 EXO 68 на 155 нанометров.
Эта настройка предназначена как для стандартного размера, так и для образцов, содержащих электромобили размером менее 200 нанометров. Выберите выборку и перейдите к записи образца в течение одной минуты. Выполните третье измерение с помощью образца воды или PBS, чтобы создать пустой обесценивающий показатель, выявляя ложные срабатывания для удаления программным обеспечением.
Разбавьте немаркированные образцы EV в PBS до подходящего диапазона концентраций частиц от одного раза 10 до восьмого-пятикратного 10-восьмого частиц на миллилитр для анализа nFCM. И загрузить от 10 до 100 микролитров разбавленного образца в загрузочный отсек. Если концентрация частиц неизвестна, начните с разбавления образца EV от одного до 100.
Концентрация образца может быть быстро аппроксимирована размером лазерного пятна на ПЗС-камере во время усиления или путем наблюдения следа всплеска события во время отбора проб. После того, как загруженный образец будет увеличен в течение 45 секунд, запишите в течение одной минуты и сохраните файл, как показано ранее. После записи начните анализ этих данных, переключившись с вкладки Acquisition на вкладку Analysis и открыв сохраненные файлы NFA.
Для точного измерения образца используйте два стандартных измерения, проведенных до измерения выборки, чтобы установить значения для сравнения образцов, а также заготовку. Создайте стандартную кривую размера для преобразования бокового рассеяния в диаметр, выбрав стандартный размер файла и используя инструмент задать пороговое значение. Пороговое значение, видимое в трассировке всплеска события, определяет минимальную интенсивность сигнала, необходимую для того, чтобы событие считалось значимым.
Установив пороговое значение, проверьте параметры точечной графики, SS-H или SS-A по оси X и FITC-A по оси Y. Откройте инструмент «Генерация стандартных кривых» и выберите S16 EXO от 68 до 155 нанометров в качестве шаблона размера. Нажмите «Найти пики», чтобы определить интенсивность рассеяния на стороне пика как частицы диаметром 68, 91, 113 или 155 нанометров.
Перед закрытием окна проверьте, была ли сгенерирована кривая рассеяния стороны до диаметра со значением R, близким к единице. Установите стандарт концентрации. Выберите сохраненный файл, нажмите на счетчик стандарта и введите концентрацию частиц стандарта.
Установите стандартную информацию. Выберите файл образца EV и установите пороговое значение. Выберите пустой файл и нажмите «Установить пустой», чтобы определить количество ложных срабатываний для удаления из подсчета образцов.
После открытия инструмента создания PDF проверьте размер, концентрацию и разбавления образца. Затем покажите концентрацию образца и распределение частиц по размерам. После маркировки образцов EV, как описано в рукописи, возьмите один микролитр меченого образца и разбавьте от одного до 50 в PBS в пробирке размером 0,6 миллилитра.
Загрузите образец в загрузочный отсек и применяйте давление наддува в течение 45 секунд. Кроме того, убедитесь, что правильные настройки лазера и соответствующие линзы загружены. Теперь переключитесь на давление отбора проб и выберите время для записи.
После получения в одну минуту присвойте файлу данных имя и сохраните его. Выгрузите образец, замените его чистящим раствором и увеличьте чистящий раствор более чем на 30 секунд перед загрузкой следующего маркированного образца, как показано ранее. Для генерации PDF применяйте те же стандарты, что и ранее.
Только пустое измерение будет установлено по-другому. Выберите образец файла и задайте пороговое значение. Выберите инструмент для измерения и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы провести линию, разделяющую флуоресцентную положительную популяцию.
Задайте имена и цвета для представления. Установите пустой файл и нажмите «Установить пустой», чтобы определить количество ложных срабатываний для удаления из каждой отдельной популяции. Откройте инструмент создания PDF и определите распределение размеров, концентрацию и процент флуоресцентной положительной субпопуляции.
На точечном графике измените ось Y, чтобы показать измерения флуоресценции из зеленого или красного канала. Установите пустое поле и создайте PDF-файл, как показано ранее. На точечном графике установите для оси X значение FITC, а для оси Y — значение APC.
Используйте инструмент квадранта для идентификации двойных флуоресцентных положительных популяций. Задайте имена и цвета, чтобы они были репрезентативными, затем откройте PDF-файл и выберите флуоресцентные подпопуляции. Электромобили, полученные из C2C12, показали примерно 50% CD9, 30% CD63 презентации и 70% населения, представленной по крайней мере одним из трех маркеров EV.
Профили размеров для субпопуляций EV, меченных одиночным тетраспанином, показали больший средний размер примерно от 75 до 85 нанометров и менее 65 нанометровых EV по сравнению с общей популяцией частиц. Электромобили, полученные из SW620, показали примерно 40% CD9, 7% CD63 и 42% частиц, имеющих, по меньшей мере, один из трех маркеров. Электромобили, полученные из SW620, меченые тетраспанином, показали более нормальное распределение и больший медианный диаметр от 90 до 110 нанометров с аналогичным распределением между отдельными тетраспанин-положительными субпопуляциями.
Мембранная маркировка неоднократно показывала 80%-ноценную позитивность электромобилей C2C12 и SW620. Интенсивность бокового рассеяния коррелировала с интенсивностью FITC на точечных графиках C2C12 и SW620. Двойные положительные проценты очень похожи на положительные проценты тетраспанина.
И маркировка CD63, по-видимому, показывает самую слабую корреляцию с мембранной маркировкой. Процентные измерения положительности были одинаковыми между маркировкой антител с дополнительной мембранной маркировкой и без нее. Средняя интенсивность флуоресценции для флуоресцентных популяций ev, полученных из C2C12, предполагает более низкое представление CD63 и CD81 по сравнению с CD9 EV, в то время как SW620 показал, что использование всех трех антител обеспечивает больший сигнал флуоресценции, чем любая отдельная метка антитела В этом протоколе общие маркеры EV были флуоресцентно помечены, но многие из мишеней антител могут быть выбраны, чтобы показать происхождение EV, функция EV, или болезненное состояние.
