Этот протокол описывает поэтапный метод радиоактивного мечения клеток и циркония-89-DBN и его неинвазивного отслеживания с помощью ПЭТ. Этот метод также обеспечивает надежный и стабильный метод радиоактивного мечения клеток путем ковалентной конъюгации циркония-89-ДБН с первичными средствами белков клеточной поверхности. Врачи и ученые, работающие с клеточной терапией неврологических заболеваний и различных видов рака, найдут этот протокол полезным для понимания фармакокинетики клеточной терапии с помощью неинвазивной ПЭТ-визуализации.
Подробный протокол содержит рекомендации для новых пользователей по изучению и внедрению этого метода радиомаркировки. Дополнительные узлы, включенные на критических этапах, помогут устранить неполадки для нового пользователя. Для начала подготовьте колонку примерно со 100 миллиграммами гидроксаматной смолы и активируйте ее, промыв колонку восемью миллилитрами чистого безводного ацетонитрила с последующей промывкой пятью-шестью миллилитрами воздуха.
Пропустите в колонку два миллилитра 0,5 нормальной соляной кислоты. Пройдя дополнительную промывку пятью-шестью миллилитрами воздуха, медленно загрузите раствор, содержащий как цирконий-89, так и природный иттрий, в гидроксаматную смолу. Несвязанный природный иттрий промыть от гидроксаматной смолы 20 миллилитрами двух нормальных соляных кислот, а затем 10 миллилитрами деионизированной воды.
Для выделения циркония в виде гидрофосфата циркония-89 добавьте в колонку 0,5 миллилитра 1,2-молярного дикалийфосфатного дигидрофосфата калия буфера и дайте ему постоять на колонне в течение 30 минут. Добавьте дополнительно 1,5 миллилитра 1,2-молярного буфера, чтобы выделить цирконий из колонки. Затем возьмите около 120 микролитров фосфата циркония-89, содержащегося в буфере, и нейтрализуйте раствор с помощью HEPES-KOH и карбоната калия до достижения pH 7,528.
Добавьте четыре микролитра свежеприготовленного пятимиллимолярного DFO-Bn-NCS примерно к 285 микролитрам нейтрализованного фосфата водорода циркония-89. И перемешать раствор пипеткой. После выделения циркония из иттрия добавьте в колонку 0,5 миллилитра одной молярной щавелевой кислоты и дайте ей постоять на колонке в течение одной минуты, чтобы цирконий выделился в виде оксалата циркония-89.
Добавьте в колонку дополнительно 2,5 миллилитра одного моляра щавелевой кислоты. Чтобы превратить оксалат циркония-89 в хлорид циркония-89, промыть анионообменную колонку шестью миллилитрами ацетонитрила, а затем промыть пятью-шестью миллилитрами воздуха. Затем промойте колонку 10 миллилитрами физиологического раствора с последующей еще одной продувкой воздухом.
Медленно загружают раствор, содержащий оксалат циркония-89, на активированную анионообменную колонку перед повторной промывкой воздухом. Затем промойте колонку 50 миллилитрами деионизированной воды, чтобы удалить несвязанный оксалат-ион. Для выделения циркония в виде хлорида циркония-89 добавьте в колонку 0,1 миллилитра одной нормальной соляной кислоты и дайте ей постоять на колонке в течение одной минуты.
Вынимаем цирконий из колонки дополнительно 0,4 миллилитра одной нормальной соляной кислоты. Высушите ускользнувший хлорид циркония-89 в V-образном флаконе, поместив его в нагревательный блок при температуре 65 градусов Цельсия под постоянным потоком газообразного азота в течение 10-30 минут, а затем восстановите высушенный хлорид циркония-89 в воде. Приготовьте 500 микролитров клеточной суспензии примерно с 6 миллионами клеток в 500 микролитрах HEPES-буфера HBSS в 1,5-миллилитровой пробирке для микроцентрифуги и добавьте примерно 100 микролитров циркония-89-DBN.
Смешайте цирконий-89-ДБН и клеточную суспензию, осторожно пипетируя раствор вверх и вниз с помощью микропипетки. Инкубируйте клетки и смесь циркония-89-ДБН на шейкере при частоте вращения около 550 об/мин при температуре от 25 до 37 градусов Цельсия в течение 30–45 минут для мечения клеток. Проведите радиоактивную ТСХ на реакции радиоактивного мечения клетки с использованием свежеприготовленного радиоактивного растворителя ТСХ.
Рассчитайте процент радиоактивности при Rf, равный 0,01-0,02, используя уравнение, показанное на экране. В отдельной пробирке для микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра смешайте около 100 микролитров циркония-89-DBN с примерно 500 микролитрами HBSS, буферизованного HEPES, чтобы использовать его в качестве бесклеточного контроля для коррекции фона. Рассчитайте процент радиоактивности при Rf, равный 0,01-0,02, используя уравнение, показанное на экране, затем рассчитайте эффективную радиоактивную маркировку ячеек путем вычитания двух рассчитанных процентов радиоактивности.
После подтверждения завершения радиомечения добавьте 600 микролитров охлажденной полной среды, соответствующей клетке, чтобы выполнить гашение реакции радиомечения. Центрифугируйте клетки при температуре 96G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. И выбросьте надосадочную жидкость.
Осторожно ресуспендируйте гранулированные ячейки в 500 микролитрах охлажденной среды, пипетируя среду вверх и вниз с помощью микропипетки. Центрифугируйте клетки при 96G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем рассчитайте окончательную эффективность радиомаркировки после всех промывок, используя уравнение, показанное на экране.
Чтобы убедиться в качестве радиоактивно меченных клеток, визуально осмотрите окончательную суспензию радиоактивно меченных клеток и, если комки отсутствуют, проведите тест на жизнеспособность трипанового синего с использованием 0,4%-ного раствора трипанового синего, приготовленного в PBS, в течение одного часа после радиомечения и этапов промывки. Хелатная эффективность DFO-Bn-NCS для циркония-89 с использованием гидрофосфата циркония-89 и хлорида циркония-89 различна при измерении радиоактивного ТСХ. Здесь показана стабильность различных клеток, меченных цирконием-89 в течение семи дней.
Было обнаружено, что удержание радиоактивности циркония-89 радиоактивно меченными клетками было стабильным во всех изученных клетках, при этом незначительный отток наблюдался в течение семи дней после мечения. Эффективность радиомечения клеток в различных типах клеток с цирконием-89-ДБН показана в этой таблице. Эффективность радиоактивного мечения клеток варьируется от 20 до 50% в виде нескорректированного выхода, наблюдаемого в радиоактивно меченных клеточных гранулах после промывки.
Наиболее важным этапом этого протокола является добавление DFO-Bn-NCS в хелатную смесь и оценка качества радиоактивно меченных клеток. Применение этой методики поможет понять фармакокинетику клеточной терапии. Это также вызовет вопросы о какой-либо клинической необходимости изменения профиля клиренса клеточной терапии.
