Este protocolo describe un método escalonado para el radiomarcaje de células y zirconio-89-DBN y su seguimiento no invasivo por PET. Esta técnica también proporciona un método fiable y estable para el radiomarcaje de células mediante una conjugación covalente de circonio-89-DBN con los medios primarios de las proteínas de la superficie celular. Los médicos y científicos que trabajan con terapias celulares para enfermedades neurológicas y diversos tipos de cáncer encontrarán que este protocolo es fundamental para comprender la farmacocinética de las terapias basadas en células a través de imágenes PET no invasivas.
El protocolo detallado proporciona orientación a los nuevos usuarios para que aprendan y adopten esta técnica de radiomarcaje. Los nodos adicionales incluidos en los pasos críticos ayudarán a solucionar problemas para un nuevo usuario. Para comenzar, prepare una columna con aproximadamente 100 miligramos de resina de hidroxamato y actívela lavando la columna con ocho mililitros de acetonitrilo anhidro puro seguido de un lavado con cinco a seis mililitros de aire.
Pase dos mililitros de ácido clorhídrico normal 0,5 a la columna. Después de pasar una descarga adicional de cinco a seis mililitros de aire, cargue lentamente la solución que contiene circonio-89 e itrio natural a la resina de hidroxamato. Lave el itrio natural no unido de la resina de hidroxamato con 20 mililitros de dos ácidos clorhídricos normales, seguidos de 10 mililitros de agua desionizada.
Para eludir el zirconio en forma de fosfato de hidrógeno de circonio-89, agregue 0,5 mililitros de fosfato dipotásico 1,2 molar tampón de fosfato de dihidrógeno potásico a la columna y déjela reposar en la columna durante 30 minutos. Agregue 1,5 mililitros adicionales de tampón molar 1,2 para eluir el circonio de la columna. A continuación, tome alrededor de 120 microlitros de fosfato de hidrógeno de circonio-89 formulado en el tampón y neutralice la solución con HEPES-KOH y carbonato de potasio para lograr un pH de 7.528.
Agregue cuatro microlitros de DFO-Bn-NCS de cinco milimolares recién preparados a alrededor de 285 microlitros de fosfato de hidrógeno de circonio-89 neutralizado. Y mezcle la solución pipeteando. Después de aislar el circonio del itrio, agregue 0,5 mililitros de ácido oxálico molar a la columna y déjelo reposar en la columna durante un minuto para eluir el circonio en forma de oxalato de circonio-89.
Agregue 2,5 mililitros adicionales de ácido oxálico molar a la columna. Para convertir el oxalato de circonio-89 en cloruro de circonio-89, lave la columna de intercambio aniónico con seis mililitros de acetonitrilo, seguido de un lavado con cinco a seis mililitros de aire. Luego, lave la columna con 10 mililitros de solución salina seguida de otra descarga de aire.
Cargue lentamente la solución que contiene oxalato de circonio-89 en la columna de intercambio aniónico activada antes de volver a lavarla con aire. Luego, lave la columna con 50 mililitros de agua desionizada para eliminar el ion oxalato suelto. Para eludir el circonio en forma de cloruro de circonio-89, agregue 0,1 mililitros de un ácido clorhídrico normal a la columna y déjelo reposar en la columna durante un minuto.
Eluir el circonio de la columna con 0,4 mililitros adicionales de un ácido clorhídrico normal. Seque el cloruro de circonio-89 eludido en un vial en forma de V colocándolo en un bloque calefactor a 65 grados Celsius bajo un flujo constante de gas nitrógeno durante 10 a 30 minutos, y luego reconstituya el cloruro de circonio-89 seco en agua. Prepare 500 microlitros de suspensión celular con aproximadamente 6 millones de células en 500 microlitros de HBSS tamponado con HEPES en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue aproximadamente 100 microlitros de circonio-89-DBN formulado.
Mezcle el zirconio-89-DBN y la suspensión celular pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta. Incubar las células y la mezcla de circonio-89-DBN en un agitador a unas 550 RPM a 25 a 37 grados Celsius durante 30 a 45 minutos para el marcaje de las células. Realice TLC radiactivo en la reacción de radiomarcaje celular utilizando solvente TLC radiactivo recién preparado.
Calcule el porcentaje de radiactividad en Rf igual a 0.01 a 0.02 usando la ecuación que se muestra en la pantalla. En un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros, mezcle alrededor de 100 microlitros de circonio-89-DBN formulado con alrededor de 500 microlitros de HBSS tamponado con HEPES para usarlo como control sin celdas para la corrección de fondo. Calcule el porcentaje de radiactividad en Rf igual a 0.01 a 0.02 usando la ecuación que se muestra en la pantalla, luego calcule el radiomarcaje celular efectivo restando los dos porcentajes de radiactividad calculados.
Después de confirmar la finalización del radiomarcado, agregue 600 microlitros de medio completo apropiado para celdas refrigeradas para realizar el enfriamiento de la reacción de radiomarcado. Centrifugar las células a 96G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Y desecha el sobrenadante.
Resuspenda suavemente las células peletizadas en 500 microlitros del medio enfriado pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta. Centrifugar las células a 96G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. A continuación, calcule la eficiencia final del radiomarcaje después de todos los lavados utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla.
Para garantizar la calidad de las células radiomarcadas, inspeccione visualmente la suspensión final de las células radiomarcadas y, si no hay grumos presentes, realice una prueba de viabilidad de exclusión de azul de tripano utilizando una solución de azul de tripano al 0,4 % preparada en PBS dentro de una hora después del marcado radiactivo y los pasos de lavado. La eficiencia de quelación de DFO-Bn-NCS para circonio-89 utilizando fosfato de hidrógeno de circonio-89 y cloruro de circonio-89 es diferente según lo medido por TLC radiactivo. Aquí se muestra la estabilidad de varias células radiomarcadas con zirconio-89 durante siete días.
Se encontró que la retención de radiactividad de circonio-89 por las células radiomarcadas era estable en todas las células estudiadas, con un eflujo insignificante observado durante siete días después del marcado. En esta tabla se muestran las eficiencias de radiomarcaje celular en diferentes tipos de células con zirconio-89-DBN. La eficiencia del radiomarcaje celular varía del 20 al 50% como un rendimiento no corregido observado en el gránulo celular radiomarcado después del lavado.
El paso más crítico de este protocolo es la adición de DFO-Bn-NCS a la mezcla de quelación y la evaluación de la calidad de las células radiomarcadas. La aplicación de esta técnica ayudará a comprender la farmacocinética de las terapias basadas en células. También plantearía preguntas sobre cualquier necesidad clínica de alterar el perfil de aclaramiento de las terapias celulares.
