Наш многопараметрический протокол проточной цитометрии позволяет быстро и лучше обнаруживать вызванное терапией старение опухолевых клеток, что является условием постоянного изучения в биологии и терапии рака. Наш анализ старения проточной цитометрии происходит быстрее, чем существующие анализы на основе микроскопии. Мы используем два маркера, а не только один, для идентификации стареющих клеток, повышая надежность анализа.
Клетки могут быть окрашены совместно флуоресцентными антителами для обнаружения дополнительных целей, представляющих интерес. Сортировка проточной цитометрии может быть использована для обогащения популяций стареющих клеток для последующего анализа. Анализ может обнаружить стареющие клетки в культивируемых линиях раковых клеток или в целых образцах опухоли после мягкой диссоциации.
Прежде чем попробовать этот метод, важно ознакомиться с общими рабочими процедурами используемого проточного цитометра. Пожалуйста, обратитесь к тексту для получения рекомендуемых спецификаций проточного цитометра. За день до индукции старения лекарственными препаратами собирают культуру линии раковых клеток с 0,25% трипсина ЭДТА.
Поместите клетки при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы активировать трипсин, и отсоедините монослой клеток. Когда монослой заметно отсоединится, нейтрализуйте трипсин, добавив равный объем полной питательной среды. Переложите клеточную суспензию в стерильную коническую трубку.
Подсчитайте клетки, используя стандартный метод гемоцитометра, и запишите клетки на миллилитр. Пластинчатые ячейки в один раз от 10 до третьего до 10 раз от 10 до третьих клеток на квадратный сантиметр в стандартной шестилуночной пластиковой культуральной пластине. Инкубируйте пластину в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа и влажностью.
На следующий день обработайте клетки интересующим вас агентом, вызывающим старение, таким как этопозид. Затем инкубируют в течение четырех дней, чтобы можно было дать начало старения. Ежедневно исследуйте клетки под световым микроскопом на предмет ожидаемых изменений морфологии.
После начала старения собирают клетки, добавляя трипсин ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Когда клетки диссоциируют на суспензию, нейтрализуют трипсин равным объемом полной среды. Перенесите каждый лунок клеточной суспензии в 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Снова подсчитайте клетки и аликвотируйте равное количество клеток на образец в новый набор пробирок. Центрифугируйте пробирки в течение пяти минут по 1000 г при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант. Во-первых, регулируют лизосомальный рН культивируемых образцов клеток путем добавления раствора одного микромолярного бафиломицина А в ДМЭМ к клеточной грануле в концентрации от одного раза 10 до шестых клеток на миллилитр и пипетки для смешивания.
Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия на ротаторе с медленной скоростью. Затем, чтобы окрасить бета-галактозидазу, связанную со старением, добавляют раствор DDAOG по 10 мкг на миллилитр к образцам без промывки. Поместите на ротатор на 60 минут, защищенный от прямого света.
Как и прежде, центрифугируйте трубки, удалите супернатант и промойте гранулу одним миллилитром ледяного холода 0,5% BSA в PBS. Затем добавьте 300 микролитров разбавленного раствора Calcein Violet 450 AM в вымытые ячейки гранул. Инкубировать в течение 15 минут на льду в темноте.
Перенесите образцы клеток в трубки, совместимые с проточной цитометрией. В программном обеспечении для сбора данных откройте гистограмму фиолетового канала и дально-красный канал по сравнению с зеленым точечным каналом. Инициируйте сбор данных цитометра на низкой скорости всасывания и размещайте положительные контрольные образцы, окрашенные DDAOG, на входном отверстии.
Начните собирать образцы данных. Отрегулируйте напряжение канала таким образом, чтобы более 90% событий содержалось в каждом графике. Когда все параметры оптимальны, запишите 10 000 событий на выборку.
Поместите контрольные образцы, окрашенные DDAOG только для транспортного средства, на впускное отверстие. Инициируйте сбор данных и записывайте 10 000 событий на выборку. Ищите увеличение автофлуоресценции, или AF, и сигнала DDAO-галактозида по сравнению с положительным контролем.
Сохраните образцы данных в формате fcs и экспортируйте файлы на компьютер рабочей станции, оснащенный программным обеспечением для анализа проточной цитометрии. Используя программное обеспечение для анализа данных цитометрии, загрузите файлы данных FCS для всех полученных образцов. Во-первых, чтобы закрыть жизнеспособные ячейки, дважды щелкните образец данных для элемента управления, предназначенного только для транспортного средства, чтобы открыть окно данных.
Визуализируйте данные в виде гистограммы фиолетового канала. Жизнеспособные окрашенные клетки, окрашенные CV 450, основаны на их более яркой флуоресценции, чем мертвые клетки. Нарисуйте ворота с помощью инструмента «Гистограмма одного затвора», чтобы включить только жизнеспособные ячейки.
Назовите ворота жизнеспособными. Затем перетащите затвор Viable на другие образцы ячеек из окна макета образца, чтобы применить затвор равномерно. Откройте окно Макет.
В окне Макет визуализируйте все образцы как гистограммы фиолетового канала. Убедитесь, что жизнеспособный забор клеток подходит для всех образцов. Если нет, отрегулируйте по мере необходимости.
Затем, чтобы закрыть стареющие ячейки, дважды щелкните данные закрытой жизнеспособной ячейки для управления только транспортным средством, чтобы открыть окно данных. Затем визуализируйте данные в виде точечной диаграммы для дальнего красного канала по сравнению с зеленым каналом. Нарисуйте затвор с помощью инструмента «Прямоугольная решетка», чтобы включить менее 5% DDAO-положительных и AF-положительных ячеек из верхнего правого квадранта.
Назовите ворота Стареющими. Затем перетащите стареющие ворота на жизнеспособное подмножество всех образцов из окна макета образца, чтобы применить ворота равномерно. В окно Макет перетащите все жизнеспособные подмножества с оболочкой ячеек.
Визуализируйте все жизнеспособные образцы в виде точечных графиков с красным и зеленым каналами и наблюдайте за результатами. Убедитесь, что стареющие ворота видны на всех участках и что ворота для управления только транспортным средством имеют менее 5% стареющих ячеек. В настоящее время анализ завершен.
Данные теперь могут быть экспортированы по желанию в графическом и табличном формате. По сравнению с необработанными клетками, стареющие клетки меланомы B16-F10, индуцированные этопозидом, демонстрировали увеличенную морфологию и синее окрашивание из-за расщепления X-gal повышенной бета-галактозидазой, связанной со старением. Окрашивание клеток, обработанных этопозидом, флуоресцентным C12FDG или DDAOG продемонстрировало сопоставимые модели окрашивания и изменения интенсивности с X-gal.
Однако было показано, что клеточная автофлуоресценция, перекрывающаяся зеленым излучением C12FDG, накапливается в незапятнанных стареющих клетках. Напротив, автофлуоресценция, как правило, была незначительной в дальнем красном диапазоне излучения DDAOG. Здесь показана настройка сбора данных проточного цитометра для графиков рассеяния, пятипиковых коммерческих радужных флуоресцентных калибровочных микросфер и одноканальных флуоресцентных данных из окрашенных клеток.
Данные анализа старения проточного цитометра DDAOG для клеток меланомы B16-F10 показали, что вызванное терапией старение, или TIS, индуцированное этопозидом, происходило в 35% жизнеспособных клеток, а сенолитический агент ABT-263 почти устранял клетки TIS. В клетках рака легких A549 блеомицин-индуцированный TIS в 66% жизнеспособных клеток и ABT-263 снизил процент до 15. ABT-263 сам по себе не был токсичен для необработанных пролиферирующих клеток.
В анализе совместного окрашивания антител гистограмма данных канала ПЭ показала, что 42% клеток, обработанных этопозидом, были положительными для маркера старения DPPP4-положительного. Кроме того, визуализация с двумерными точечными графиками показала, что 44% клеток, обработанных этопозидом, были вдвойне положительными для DDAOG и DPP4 по сравнению с 4% клеток, предназначенных только для транспортных средств. Затем оценивалась фиксация окрашенных DDAOG клеток.
По сравнению с нефиксированными контрольными образцами, фиксированные образцы демонстрировали несколько более высокий фон в необработанных клетках с более высоким процентом клеток, оцениваемых как стареющие в клетках, обработанных BLM. Этот эффект также наблюдался в фиксированных образцах, хранящихся в течение ночи, и в течение одной недели при четырех градусах Цельсия. Показана проточная цитометрическая сортировка и валидация обогащенных популяций стареющих клеток по морфологии и маркерам пролиферации.
Отсортированные стареющие клетки показали увеличенную морфологию, как и ожидалось, визуализированную окрашиванием актина флуоресцентным фаллоидином. Снижение сигнала для маркера пролиферации Ki67 также наблюдалось при иммунофлуоресцентном окрашивании. Наконец, была оценена количественная оценка старения в опухолях, обработанных химиотерапевтическими препаратами.
Окрашивание X-gal в тканях было относительно слабым, но синее окрашивание было очевидно при опухолях, обработанных доксорубицином или пегилированным липосомальным доксорубицином, особенно в опухолях, которые также получили положительный результат на старение с помощью анализа потока DDAO-галактозида. Как и ожидалось, опухоли, содержащие только физиологический раствор, показали незначительное старение. Здесь, как и в случае с любым анализом живых клеток, шаги протокола должны выполняться эффективно, но мягко.
Следует избегать длительных процедур окрашивания или инкубаций сверх упомянутого времени. Если стареющие клетки отсортированы цитометрически, их можно поместить обратно в культуру для иммуноанализа или лизировать и обработать для анализа омики, включая транскриптомику или протеомику. Этот метод позволил нашей лаборатории и другим идентифицировать новые особенности стареющих опухолевых клеток, включая количественную оценку повреждения ДНК, экспрессию белка и изменения в метаболизме.
