В этом видео показано, как оценить иммуногенность in vivo внеклеточных везикул, полученных из опухоли, или EV, с помощью проточной цитометрии. Способ скрининга, описанный в настоящем описании, относительно прост в выполнении и может быть адаптирован к различным условиям. При онкологических заболеваниях выявление состояний иммуногенных внеклеточных пузырьковых высвобождений имеет особую трансляционную значимость.
Таким образом, аутологичные электромобили могут использоваться в качестве персонализированного противоракового лечения. Демонстрировать первую часть процедуры будет Татьяна Неделько, технический ассистент из моей лаборатории. Чтобы начать подготовку клеточных культуральных сред, необходимых для внеклеточных пузырьков, или EV, истощают бычьи EV в среде FCS путем ультрацентрифугирования в 100 000 раз в г в течение 24 часов при 4 градусах Цельсия.
Выбросьте гранулу после центрифугирования. Извлеките из культуры мышиные клетки меланомы B16, экспрессирующие овальбумин, или клетки B16-OVA, и дважды промывайте клетки PBS. Затем засейте клетки в концентрации 400 000 клеток на миллилитр в среде, обедненной EV.
Затем обработайте клетки B16-OVA 30 микрограммами оксалиплатина на миллилитр и инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия с необработанными контрольными образцами. Через 24 часа соберите супернатант в центрифугу в 400 раз г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. Выбрасывайте гранулу перед центрифугированием снова по 2 000 г в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
После выброса гранулы отфильтруйте супернатант через 220-нанометровый мембранный фильтр PVDF в свежую трубку. Затем смешайте 1 миллилитр супернатанта с 0,5 миллилитрами специального коммерчески доступного реагента выделения экзосом. Вихрь и переложите смесь в 1,5-миллилитровые трубки с последующей ночной инкубацией при 4 градусах Цельсия.
На следующий день центрифугируют смесь в 10 000 раз в г в течение 60 минут при 4 градусах Цельсия. После тщательного выброса супернатанта удалите оставшиеся капли, постукивая 1,5-миллилитровой трубкой вверх ногами по бумажному полотенце и аспирацией через тонкий наконечник пипетки, не касаясь гранулы EV внизу. Повторно суспендируйте гранулу в холодном PBS путем пипетки вверх и вниз, не царапая гранулу наконечником.
Затем объедините электромобили из всех труб. Если вы не используете немедленно, храните суспензии EV при температуре 80 градусов Цельсия в силиконизированных сосудах в течение 28 дней до нанесения. Чтобы иммунизировать каждую мышь в группе лечения EV, выделенными от 4,0 x 10 до пятых клеток B16-OVA, смешайте 5 микролитров суспензии EV с 55 микролитрами холодного PBS.
Затем заполните шприцы, установленные иглами от 26 до 30 калибра, 60 микролитрами разбавленных электромобилей или PBS, а затем сразу же положите шприц на лед. Инокулируют EV или PBS подкожно в медиальный аспект бедра мышей. Повторите иммунизацию через семь дней.
Через 14 дней после первой обработки принесите мышей в жертву, чтобы резецировать селезенку. Затем размять резецированную селезенку с помощью смоченного 100-микрометрового клеточного сетчатого фильтра и пластикового плунжера шприца. Промывайте селезеночные клетки в 50-миллилитровую трубку с 5-10 миллилитрами холодного полного RPMI.
Затем центрифугируйте клетки в 400 раз г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия, прежде чем выбросить супернатант. Чтобы удалить эритроциты из клеточной суспензии, повторно суспендируют и инкубируют клеточную гранулу с 2 миллилитрами буфера лизиса эритроцитов в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем остановите реакцию, добавив от пяти до 10 миллилитров полного RPMI с последующим центрифугированием, как описано ранее.
После повторного использования клеточной гранулы в полном RPMI подсчитайте клетки каждой мыши и поместите трипликаты 200 000 спленоцитов с 200 микролитрами cRPMI в каждую лунку 96-луночной пластины с U-образным дном. Затем высиживают пластины в течение 48 часов при 37 градусах Цельсия. Через 48 часов обработайте культуру клеток 5 нанограммами на миллилитр брефельдина А, 20 нанограммами на миллилитр PMA и 1 микрограммом на миллилитр иономицина при 37 градусах Цельсия в течение 4 часов.
После инкубации переложите спленоциты на 96-луночную пластину с V-образным дном и дважды промывайте клетки PBS. Повторно суспендируют гранулированные спленоциты в свежеприготовленном окрашивающем растворе и инкубируют клеточную суспензию в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, защищенной от света. Для фиксации и пермеабилизации дважды промыть спленоциты в FACS-буфере, а затем повторно суспендировать спленоциты в 100 микролитрах на лунку раствора для фиксации и пермеабилизации с последующей инкубацией в темноте, как объяснялось ранее.
Для окрашивания внутриклеточного интерферона гамма промыть спленоциты в буфере фиксации или пермеабилизации перед повторной отправкой клеток флуоресцентными антителами против интерферона, разбавленным 1:200 в буфере. Инкубируйте спленоциты в течение 1-12 часов при 4 градусах Цельсия в темноте. После тщательной промывки и повторного суспендирования в FACS-буфере, проанализируйте активацию цитотоксических Т-клеток в соответствии со стратегией гатинга, описанной в рукописи.
На репрезентативном изображении показана стратегия гатинга для анализа активации цитотоксических Т-клеток. Клетки были закрыты как одиночные клетки, подмножество лимфоцитов, жизнеспособные CD3-положительные Т-клетки и CD4-отрицательные CD8-положительные цитотоксические Т-клетки. Внутриклеточное накопление гамма-интерферона оценивали как суррогатный маркер активации.
После иммунизации EV, полученными из опухолевых клеток, была изучена индукция антиген-специфических ответов Т-клеток у мышей-реципиентов. Полученные из опухоли EV, культивируемые в условиях генотоксического стресса, такие как лечение оксалиплатином, индуцировали мощную активацию селезеночных цитотоксических Т-клеток в отличие от необработанных EV. Группа животных, получавшая лечение от транспортных средств, показала самый низкий ответ.
Активацию селезеночных Т-клеток определяли после рестимуляции ex vivo либо в присутствии, либо в отсутствие овальбумина. Выработка интерферона гамма была увеличена, когда спленоциты опухолевых EV-обработанных животных были рестимулированы модельным опухолевым антигеном овальбумином перед анализом. Обратите внимание, что воспроизводимые результаты зависят от постоянной эффективности изоляции электромобилей.
Таким образом, убедитесь, что гранулы EV полностью и быстро повторно суспендированы, чтобы избежать высыхания. С помощью этого протокола мы смогли проанализировать специфические пути в опухолевых клетках, которые определяют иммуногенность EV, полученных из опухолевых клеток. Это может проложить путь к использованию таких иммуногенных EV в лечении рака.
