Выделение или обогащение небольших дисперсных областей, представляющих интерес, из FFPE или свежезамороженного материала может быть достигнуто с помощью автоматизированного рассечения быстрее и эффективнее, чем с помощью традиционных методов. Извлечение геномного материала из FFPE, или свежезамороженной ткани, является требованием для многих клинических и трансляционных исследовательских лабораторий. Автоматизированное рассечение заполняет значительный разрыв между макродиссекцией и микродиссекцией лазерного захвата.
Для начала аннотируйте отсканированные изображения слайдов для интересующих опухолевых областей, используя предоставленную поставщиком смотровую платформу или средство просмотра с открытым исходным кодом. Поместите незапятнанный слайд образца ткани на сцену в первом-четвертом положении слайда при использовании цифровой ссылки на слайд. Создайте задание фрезерования с помощью автоматизированного программного обеспечения для рассечения тканей, открыв список заданий, затем выберите Создать новое задание и введите идентификатор дела и имя, чтобы ввести имя задания.
Перейдите в раздел Толщина и выберите толщину секции с помощью вкладки со стрелкой вверх или вниз. Затем перейдите в раздел Подготовка тканей и выберите Парафинизированный или Депарафинизированный. Выберите Эталонное изображение"Из файла и Импорт изображения.
Затем выберите файл для импорта из раскрывающегося списка в качестве цифровой ссылки. Отсканируйте рабочую область, нажав кнопку «Этап сканирования» в правом нижнем углу, чтобы захватить каждый слайд образца ткани в первой-четвертой позиции. Для ссылки на рабочую область перетащите поле, чтобы создать прямоугольную область над тканью, и выберите круглый пузырь под прямоугольной областью, чтобы захватить эталонное изображение стадии.
Скопируйте это прямоугольное поле на оставшиеся слайды образца ткани во втором-четвертом положениях слайда, выбрав параметр копирования в правом верхнем углу эталонного изображения. Затем выровняйте и измените размер по мере необходимости. Для цифрового эталонного изображения наложите изображение на выбранную прямоугольную область.
Затем значительно измените размер и выровняйте цифровую ссылку, конечно, масштабируйте, чтобы наилучшим образом соответствовать размеру и положению над тканью образца. Скопируйте это прямоугольное поле на оставшиеся слайды образца ткани во втором-четвертом положениях слайда, выбрав параметр копирования в правом верхнем углу эталонного изображения. Затем выровняйте и измените размер по мере необходимости.
Нажмите кнопку «Этап сканирования» в правом нижнем углу, чтобы перейти к шагу тонкой настройки. Выберите положение первого этапа и значок инструмента «Трансформирование» на правой панели инструментов, чтобы выполнить точное выравнивание и корректировку масштаба ссылки в соответствии с примером наложения слайдов. Используйте ссылку на скользящую панель образца в нижней части экрана, переключаясь между эталонными и образцами изображений.
А также функция увеличения и уменьшения масштаба для настройки и достижения выравнивания каждого положения слайда. После достижения оптимального наложения образца нарисуйте обозначения контура фрезерования на цветной части маскированного эталонного изображения, выбрав значок инструмента палитры цветов на панели инструментов справа. Нарисуйте контуры фрезерования на образцах слайдов, нажав кнопку «Получить аннотации» в правом нижнем углу экрана.
Захватите и соберите интересующую аннотированную область с помощью четырех или менее фрезерных наконечников при расчете пути фрезерования. Использование фрезерного наконечника в левом верхнем углу рассчитывается на основе площади покрытия и выбранного размера наконечника. Размер наконечника может быть изменен под стрелкой фрезерного наконечника, и использование наконечника будет пересчитано.
Когда контур фрезерования выбран в первой позиции слайда, он будет скопирован в остальные позиции слайда. Нажмите кнопку «Этап настройки» в правом нижнем углу экрана для оперативной загрузки фрезерных наконечников из коллекторных трубок в их надлежащем обозначении на сцене. Заполните резервуар тремя миллилитрами соответствующего буфера рассечения для типа ткани и для последующей экстракции нуклеиновых кислот.
Затем нажмите кнопку «Рассекать» в правом нижнем углу экрана. После автоматического вскрытия извлеките из сцены сборные трубки и рассеченные слайды образцов. Поместите трубки для сбора в стойку для трубок, а слайды — в стойку для скольжения.
Окрашенный формалин H & E, встроенный фиксированный парафин и свежезамороженные участки печени мыши, содержащие метастатический колоректальный рак в ксенотрансплантатах, были отсканированы на целом слайд-тепловизоре с 20-кратным увеличением и использованы в качестве эталонных слайдов. Окрашенные H&E эталонные слайды были аннотированы и замаскированы в цифровом виде для опухолевых областей для рассечения и экстракции нуклеиновых кислот. Слайды образцов после вскрытия были окрашены H&E, чтобы подтвердить области рассечения на слайдах размером 10 микрометров и 20 микрометров.
Захваченные метрики продемонстрировали успех автоматизированной диссекции и экстракции нуклеиновых кислот. При попытке использовать этот протокол имейте в виду, что достижение относительно точного наложения аннотации на незапятнанные слайды важно для выделения областей, представляющих интерес.
