Серьезным препятствием для лечения рака является ограниченный доступ терапевтических средств к более глубоким опухолевым клеткам из-за физиологических барьеров. Таким образом, разработка новых молекулярных транспортеров, способных лечить биологические барьеры, крайне желательна для повышения эффективности доставки лекарств. Целью этой процедуры является синтез циклических пептидов, проникающих в клетки, для усиленного проникновения от клетки к клетке.
Преимущество этого метода заключается в том, что пептидная циклизация может быть легко достигнута путем реакций замещения цистеинами и смолой без использования каких-либо металлических катализаторов. Включение ароматических поперечных связей улучшает общую гидрофобность пептидов по сравнению с гидрофильными лактамными или триазоловыми поперечными связями, тем самым повышая их проницаемость. Для начала соберите ручной аппарат синтеза пептидов в вытяжном шкафу.
Установите трехходовые запорные краны на вакуумный коллектор и подсоедините их к азоту. Обязательно закройте неиспользуемые впускные отверстия. Прикрепите полипропиленовую колонну объемом 10 миллилитров к трехсторонним запорным кранам и слейте реакционную смесь или растворители из полипропиленовой колонны с помощью резиновой колбы для пипетки или вакуума через ловушку для отходов.
Чтобы подготовить смолу к синтезу пептидов, добавьте от 4 до 5 миллилитров ДМФА к необходимому количеству смолы и перенесите ее в полипропиленовую колонну с мягким барботированием азота в течение 30 минут, чтобы смола набухала должным образом. Слейте ДМФ и добавьте в смолу от 4 до 5 миллилитров 50% морфолина/ДМФ. Аккуратно взбейте азот в течение 30 минут, чтобы удалить N-концевую группу Fmoc, а затем слейте смесь.
Тщательно промойте смолу три раза, добавив в колонку от 4 до 5 миллилитров ДМФА и каждый раз барботируя азотом не менее 1 минуты. Таким же образом трижды промывайте смолу дихлорметаном и трижды ДМФ. Затем растворите 648,8 миллиграмма аргинина, защищенного Fmoc и PBF, и 372,6 миллиграмма HATU в 5 миллилитрах DMF в центрифужной пробирке.
Добавьте 348,4 микролитра DIPEA, чтобы активировать реакцию связи, и перенесите реакционную смесь в полипропиленовую колонну со смолой. Осторожно перемешайте смесь с барботированием азота в течение 1-2 часов, а затем повторите реакцию соединения один раз. Слейте реакционную смесь и последовательно промойте смолу ДМФ, дихлорметаном и снова ДМФА три раза каждый в течение не менее 1 минуты каждый раз.
Удалите защитную группу Fmoc и промойте смолу, следуя процедуре, показанной ранее, прежде чем приступить к соединению следующей аминокислоты. Затем соедините бета-аланин в качестве прокладки для маркировки FITC, используя тот же процесс, который показан для связывания аминокислот, а затем добавьте смесь FITC, DIPEA и DMF в полипропиленовую колонку в темноте, чтобы выполнить маркировку пептидов FITC на смоле. Реакция займет почти 8 часов.
Чтобы выполнить циклизацию линейного пептида, добавьте смесь трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана и дихлорметана в полипропиленовую колонну в течение 2 минут для селективного удаления тритил-защитной группы цистеина. Слейте смесь и повторяйте процедуру до тех пор, пока желтоватый раствор не станет бесцветным, чтобы полностью удалить тритил-защитную группу. Выполните последовательную промывку смолы ДМФА и дихлорметаном не менее трех раз и растворите 4, 4'бис-бромметилбифенил в ДМФА с помощью DIPEA.
Добавьте раствор в колонку и реагируйте в течение 4 часов. Промойте смолу 4-5 миллилитрами метанола дважды по пять минут каждый и высушите ее непрерывным потоком азота. Для пептидов, содержащих цистеины, обработайте смолу эффективным коктейлем для расщепления трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана и воды или трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана, 1, 2-этанедитиола и воды.
Обработайте связанную пептидами смолу в течение 2-3 часов, чтобы расщепить пептид, а затем осторожно удалите трифторуксусную кислоту струей азота. Чтобы получить сырые пептиды, добавляют от 4 до 5 миллилитров диэтилового эфира к расщепленному пептидному препарату для осаждения неочищенных пептидов и центрифугу при 10 000 x g в течение 4 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и высушите пептид на воздухе в течение 3 минут в эффективном вытяжном шкафу.
Растворите мелкомасштабный сырой пептид в 800 микролитрах ацетонитрила, а затем проанализируйте его с помощью обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Инокулируют 100 000 клеток HeLa в 2 миллилитра DMEM в 12-луночную камеру со вставкой пластины для культивирования тканей и инкубируют в течение 24 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, содержащем 5% углекислого газа. Удалите среду и инкубируйте клетки в камерах с 1 миллилитром 10 микромоляров FITC-R8 или FITC-sR8-4 в ДМЭМ без FBS в течение 1 часа.
После этого удалите среду, содержащую пептиды, и трижды промойте клетки 1 миллилитром PBS. Добавьте 1 миллилитр свежего DMEM без FBS в камеры, а затем совместно инкубируйте клетки HeLa в камере со вставленной пластиной для культивирования тканей с клетками HeLa на круглых покровных стеклах внизу в течение 2 часов. Закрепите клетки HeLa на круглых покровных стеклах 2,5% глутаровым альдегидом в течение 15 минут, а затем окрашивайте клетки DAPI в течение 15 минут.
Наконец, понаблюдайте за клетками HeLa на покровных стеклах под флуоресцентным микроскопом. Представлена принципиальная схема синтеза меченного FITC линейного пептида R8 и меченного FITC скрепленного пептида R8. На этом рисунке показаны спектры ВЭЖХ и МС линейного пептида R8 и сшитого пептида R8.
Время удержания сшитого пептида было значительно больше, чем у линейного аналога, что указывает на повышенную общую гидрофобность пептида после циклизации с гидрофобной сшивкой. Это графическое изображение представляет стабильность линейного пептида и сшитого пептида в присутствии 25% FBS. Циклический R8 остается на 77,3% нетронутым после инкубации с FBS в течение 4 часов, в то время как его линейный аналог был в основном деградирован, что свидетельствует о повышенной протеолитической стабильности циклического пептида R8.
Здесь показаны изображения флуоресцентной микроскопии живых клеток HeLa и клеток 4T1 после 1-часовой инкубации с 3-микромолярным линейным пептидом R8, меченным FITC, и меченным FITC сшитым пептидом R8. Можно видеть, что клетки, обработанные циклическим R8 с ароматической поперечной связью, проявляли более высокую внутриклеточную флуоресценцию, чем клетки, обработанные их линейным аналогом. Аналогичные результаты были получены при анализе проточной цитометрии.
Для дальнейшего изучения того, обеспечивает ли циклический R8 усиленное проникновение от клетки к клетке, были использованы трансвелл-модели для моделирования барьерной проницаемости пептидов от одного клеточного слоя к другому. Циклический R8 явно демонстрировал более высокое трансбарьерное проникновение, чем линейный пептид R8, о чем свидетельствует значительное увеличение внутриклеточной флуоресценции. Полное снятие защиты тритильной группы цистеина и смолы важно для следующего этапа циклизации.
Кроме того, эффективность циклизации также зависит от конкретных последовательностей и длины пептидов из-за стерических эффектов. В таком случае было бы полезно использовать смолу с более низкой нагрузочной способностью или циклизировать пептиды в разбавленных концентрациях в фазе раствора. Эти циклические пептиды показали повышенную проницаемость между клетками по сравнению с их линейными аналогами.
Мы считаем, что они имеют большие перспективы для преодоления биологических барьеров и будут использоваться в качестве молекулы для дальнейшего применения в области доставки лекарств.
