Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы представить оптимизированный метод выделения гепатоцитов у мышей после частичной гепатэктомии без необходимости центрифугирования градиента плотности. Обычно мы видим большой процент липидных гепатоцитов во время ранней регенерации. Те стеатотические гепатоциты, которые обычно теряются при центрифугировании градиента плотности из-за низкой плотности, сохраняются с помощью этого протокола.
Чтобы подготовить перфузионное оборудование, подсоедините канюлю IUI 26 калибра к выходному концу трубки с помощью замкового соединителя Luer. Затем промойте трубку и вставьте входной конец трубки в предварительно подогретую перфузионную буферную трубку на водяной бане. Заправьте его теплым буфером для перфузии со скоростью насоса три миллилитра в минуту.
Прежде чем приступить к операции, убедитесь, что мышь адекватно обезболивается. Затем очистите брюшную полость хирургическим раствором скраба и 70% этанолом. Затем наложите швы, чтобы снова открыть разрез средней линии, ранее сделанный для частичной гепатэктомии, и осторожно раздвиньте края раны.
Если гепатэктомия старше 24-48 часов, снимите шов и разрежьте кожу ножницами или скальпелем. Используйте ретрактор или простые зажимы, чтобы держать живот открытым. Брюшная полость должна быть максимально открыта для оптимизации доступа и визуализации.
Закрепите полипропиленовый шов 5-0 на грудине. Потяните его краниально и зафиксируйте в таком положении. Переместите кишечник вправо с помощью стерильных ватных тампонов, чтобы открыть воротную вену и полую вену.
Используйте влажную ткань, чтобы сохранить кишечник. Поместите тяжелый предмет высотой примерно два сантиметра, например металлическое утяжелительное кольцо, рядом с задними лапами мыши. Затем поместите трубку с подключенной канюлей IUI 26 калибра на объект и осторожно поместите иглу поверх полой вены.
При необходимости отрегулируйте длину трубки. Перенесите исходный раствор коллагеназы в предварительно подогретую буферную трубку для сбраживания. Приготовьте от 10 до 20 миллилитров буфера для пищеварения на одно животное.
Включите насос после регулировки скорости насоса до трех миллилитров в минуту. Выбросьте первые два-три миллилитра предварительно подогретого перфузионного буфера, как только буфер достигнет иглы. Чтобы выполнить канюляцию нижней полой вены, используйте стерильный ватный тампон, чтобы осторожно потянуть полую вену каудально ниже прокола, чтобы обеспеченное натяжение облегчило введение канюли в вену.
Вставьте канюлю IUI 26 калибра под небольшим углом в нижнюю полую вену под почкой, пока буфер проходит через иглу. Убедитесь, что скос иглы направлен вверх. Ищите кровь в камере вспышки катетера, когда игла входит в просвет.
Продвинуте иглу еще на два-три миллиметра, чтобы убедиться, что кончик катетера входит в вену. Наденьте пластиковый катетер на иглу и в полую вену еще на пять миллиметров. Извлекайте иглу медленно и очень осторожно.
Через две-три секунды ищите белые пятна, образующиеся в печени, или отек воротной вены, что указывает на то, что буфер перфузии протекает через печень и поступает в дольки печени из центральной вены. Подождите, пока воротная вена заметно набухнет в течение одной-двух секунд после образования белых пятен на поверхности печени. Разрежьте воротную вену ножницами как можно дальше от печеночного жила.
Увеличьте скорость потока до четырех-семи миллилитров в минуту в зависимости от веса животного, размера печени и степени первоначальной гепатэктомии. Зажмите воротную вену пинцетом или сосудистым зажимом на семь-10 секунд. Убедитесь, что жидкость не проходит.
Выполните второй зажим примерно через 30 секунд и убедитесь, что печень набухает и расслабляется. Продолжайте промывать животное в течение трех-четырех минут и наблюдайте за прозрачным буфером, вытекающим из воротной вены. Зажмите воротную вену на три-четыре секунды, прежде чем буфер пищеварения достигнет печени.
Убедитесь, что печень расслабляется после отпускания зажима и что перфузионная жидкость остается чистой. Как только буфер пищеварения достигнет печени, снова зажмите воротную вену. Печень не должна расслабляться после отпускания зажима.
Переваривайте примерно четыре минуты при скорости потока пять миллилитров в минуту. По мере того, как пищеварение прогрессирует, ищите признаки начала набухания печени и небольшие прозрачные участки на поверхности печени. Обратите внимание, что печень приобретает текстуру мокрого куска ткани и кажется почти мокрой.
Прощупайте консистенцию, осторожно прикоснувшись к ней влажным стерильным ватным тампоном. Продолжайте перфузию до тех пор, пока не будет наблюдаться заметная разница в текстуре поверхности печени. Обратите внимание, что печень приобретает очень светлый цвет и пузырящийся вид, указывающий на то, что капсула Глиссона отделяется от паренхимы.
Прекращают пищеварение, как только печень приобрела эти свойства. Извлеките иглу до того, как воздух попадет в печень. Возьмитесь за центральную соединительную ткань между долями с помощью щипцов и слегка приподнимите ее вверх, используя в качестве опорной точки.
Перережьте все соединения печени с другими органами и удалите желчный пузырь. Аккуратно извлеките печень из брюшной полости. Будьте осторожны, так как на этом этапе он будет хлипким и хрупким.
Поместите печень в ледяной буфер для консервации. Переложите печень в 10-сантиметровую чашку Петри и добавьте 10 миллилитров ледяного Williams'Medium E. Разорвите капсулу Глиссона пинцетом с тонким наконечником в нескольких местах вдоль поверхности печени. Возьмитесь за центральную часть двумя парами пинцета.
Медленно раздвиньте их, позволяя капсуле разорваться, не повреждая гепатоциты, и освободите клетки, осторожно встряхнув капсулу. Отфильтруйте пять миллилитров пульпы печени через 100-микрометровое ситечко для клеток в 50-миллилитровую пробирку. Промойте фильтр 10 миллилитрами свежей ледяной среды и процедите оставшиеся пять миллилитров мякоти через ситечко для ячеек.
Отжимайте экстракт при 50 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте большую часть надосадочной жидкости, оставляя один миллилитр для ресуспендирования клеток, осторожно закручивая трубку. Добавьте 40 миллилитров холодного Williams'E Medium и повторите шаг три раза.
Приступайте к выделению гепатоцитов, как описано в текстовой рукописи. После 70% гепатэктомии у мышей окончательный выход гепатоцитов составлял примерно от 10 до 15 x 10 к 6-му с 78% средней конечной жизнеспособностью. В то время как после расширенной гепатэктомии 86% выход гепатоцитов составлял от четырех до девяти x 10 до 6-го при средней жизнеспособности 65%.
После частичной гепатэктомии гепатоциты показывают увеличенный размер клеток по сравнению с нормальной печенью, что соответствует повышенному содержанию липидов. Повышенное содержание липидов наблюдалось в мышиных гепатоцитах через 24 часа после частичной гепатэктомии, что проявлялось как увеличение зернистости или непосредственно наблюдалось по наличию липидных везикул внутри увеличенных гепатоцитов. При использовании классического метода очистки градиента плотности крупные жировые гепатоциты терялись в надосадочной жидкости, и только более мелкие постные гепатоциты собирались в клеточной грануле.
Благодаря усовершенствованному протоколу заполненные липидами гепатоциты не были потеряны, и все гепатоциты были гранулированы. Повторяющийся зажим облегчает процесс промывки. При этом печень оптимально очищается от оставшихся компонентов крови, которые могут ингибировать ферменты пищеварения.
