Изоляция предсердий миоцитов для использования в экспериментах патч-зажима значительно продвинула наши знания и понимание электрофизиологии предсердий как на клеточном, так и на молекулярном уровнях. Подход, который мы используем, эффективно дает большое количество изолированных миоцитов предсердий, которые могут быть использованы для исследования клеточной электрофизиологии предсердий и аритмии в широком диапазоне экспериментальных моделей и условий. Мы приняли подход пищеварения ствола для изоляции предсердий миоцитов.
Преимущество такого подхода заключается в том, что он позволяет исследователю выбрать конкретный регион, который он хотел бы исследовать. Начните эту процедуру с подготовки оборудования и решений, описанных в текстовом протоколе. Выложить вскрытую пластину, рассекая инструменты, пипетки Пастера и отполированные пипетки.
Этот протокол может быть выполнен на мышах мужского или женского дикого типа, мышах, несущих генетические мутации, и мышиных моделях болезней. После эвтаназии мыши, как описано в текстовом протоколе, поместите мышь на бумажное полотенце или пробковую доску и заклеить лапы вниз, чтобы держать мышь на месте. Влажная грудь мыши с 70% этанола.
Удалите мех и кожу, покрывающую грудь с помощью изогнутых ножниц. Затем используйте миппы крысиного зуба, чтобы поднять грудину, а затем сократить диафрагму вдоль края ребер. Удалите всю грудную клетку с помощью изогнутых ножниц, чтобы разоблачить сердце.
Чтобы удалить придаток предсердий, аккуратно поднимите придаток с помощью тонкого вскрытия тибры и вырежьте его весенними ножницами. Немедленно перенесите придаток предсердий в кремниевое рассеченное блюдо, содержащее 20 миллилитров разогретого модифицированного раствора tyrode's pH 7.4. Поместите один вскрытый штифт в верхней части и один штифт в нижней части отверстия придатка предсердий.
Используя пипетки Pasteur, промыть атрия с разогретой модифицированной tyrode рН 7.4 раствор для удаления крови. Откройте придаток предсердий, прорезая его верхний и нижний край. Затем прикрепите углы придатка предсердий вниз, чтобы создать плоский прямоугольный кусок ткани.
Разрежьте придаток предсердий примерно на 8-10 полос одинакового размера с помощью пружинных ножниц и тонких типсов. Обратите внимание, что полосы контракт, как только они вырезаны из основной части ткани. Используя небольшую отполированную трубу, перенесите полоски ткани в первую трубку, содержащую прогретый модифицированный раствор tyrode's pH 6.9.
Подожди пять минут. Теперь, используйте средний родила огонь полированной пипетки для передачи ткани полосы на второй круглый дном трубки, содержащей модифицированный tyrode в рН 6.9 раствора. Чтобы вымыть полоски ткани, крышка пять миллилитров круглые дном трубки и осторожно инвертировать трубку три раза.
Пусть ткани полосы оседают на дне трубки перед передачей ткани полосы в третью трубку с помощью среднего родила огонь полированной пипетки. Вымойте полоски снова инверсией. Затем перенесите полоски ткани в ферментный раствор, используя средний огонь полированной пипетки и инкубировать в течение 30 минут.
Закружить трубку каждые три-пять минут, чтобы предотвратить полосы ткани от прилипния друг к другу. В начале энзиматичного пищеварения полоски тканей быстро оседают после закрученного. Примерно через 20 минут после закручения полоски ткани начинают плавать в энзиматическом растворе.
За это время полоски предсердий также меняются во внешнем виде от бледно-розового до белого, поскольку они перевариваются. После энзиматической пищеварения выполните три стирки с использованием 2,5 миллилитров раствора КБ в подготовленных пяти миллилитровых круглых дном трубках. Для каждой стирки, осторожно инвертировать трубку три раза, прежде чем двигаться ткани к следующей трубке с помощью среднего родила огонь полированной пипетки.
После окончательной стирки перенесите полоски в 14-миллилитровую круглую нижнюю трубку, содержащую 2,5 миллилитров раствора КБ. Подожди пять минут. Аккуратно тритурировать ткань в течение 7,5 минут с помощью широкой скважины огонь полированной пипетки.
Это механически разобщит полоски тканей и даст облачный раствор, наполненный отдельными миоцитами предсердий. Первая из тритурации должна быть адаптирована для того, чтобы дать большое количество клеток без повреждений клеток. Рассмотрим такие факторы, как возраст мышей и состояние болезни.
Портной силу тритурации к индивидуальной изоляции путем изменения частоты и скорости изгнания полос ткани из широкого родила огонь полированной пипетки. Нежная тритурация приводит к низкой урожайности клеток, в то время как суровая тритурация даст много мертвых клеток. Заполните 14 миллилитровую круглую дном трубку, содержащую тритурированные полосы ткани с раствором КБ до конечного объема от семи до 10 миллилитров в зависимости от желаемой плотности клеток для экспериментального использования.
Поместите эту трубку при комнатной температуре в течение одного часа. После этого инкубационный период, клетки могут быть использованы для различных экспериментов на срок до семи часов. Здесь показаны примеры изолированных предсердий миоцитов от нормальных мышей.
Изолированные миоциты предсердий, как правило, порядка 100 микрон в длину и 10 микрон в ширину с четкими полосами. Емкость изолированных предсердий миоцитов, как правило, от 40 до 70 пикофарадов. Показан пример потенциала действия предсердий миоцитов, зарегистрированного с использованием перфорированной техники патч-зажима в текущем режиме зажима.
Представительное семейство тока натрия было зарегистрировано во всей клеточной конфигурации метода патч-зажима. Эти токи были записаны с использованием 50 миллисекундных шагов зажима напряжения между отрицательными 100 и положительными 10 милливольтами от удерживаемого потенциала отрицательных 120 милливольт. Краткое отношение напряжения тока натрия представлено здесь.
Представительное семейство токов кальция было зарегистрировано с использованием 250 миллисекундных шагов зажима напряжения между отрицательными 60 и положительными 80 милливольтами от удерживаемого потенциала отрицательных 70 милливольт. Краткое отношение напряжения тока кальция отображается здесь. Представительное семейство калийных течений было зарегистрировано с потенциалом 80 милливольт с использованием 500 миллисекундных шагов зажима напряжения между отрицательными 120 милливольтами и положительными 80 милливольтами.
Здесь краткое текущее напряжение отношения показано для общего тока калия. Важно помнить, что успешная изоляция предсердий миоцитов зависит как от соответствующего энзиматического пищеварения, так и от механической диссоциации клеток во время тритурации. После изоляции, предсердий миоциты могут быть использованы в патч-зажим экспериментов для измерения действия потенциальных морфологии и ионных токсов, таких как токи натрия, токи кальция, и калийных течений.
Исследование изменений в электрофизиологии предсердий миоцитов имеет важное значение для определения клеточной и молекулярной основы опасных для жизни аритмий предсердий, а также для разработки и тестирования антиаритмических соединений на аритмии предсердий.
