Протокол активации и расширения микропузырьков важен, потому что он удовлетворяет основную неудовлетворенную потребность в исследованиях и производстве клеточной терапии, улучшая персистенцию и эффективность терапии Т-клетками. Метод положительного отбора, активации и расширения Akadeum, основанный на плавучести, ограничивает чрезмерную стимуляцию и последующее истощение Т-клеток во время рабочих процессов активации и расширения. Для начала инкубируют 3 раза 10 до 8-го коммерчески полученных НБМК в 2,5 миллилитрах буфера разделения с биотинилированным анти-CD3 антителом.
Аккуратно перемешайте компоненты путем пипетки и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавляйте в клетки очищенные микропузырьки авидина в соотношении 0,5 к 1, согласно инструкциям производителя. И смешивать с помощью коммерческого торцевого ротатора при 20 об/мин в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
Центрифуга при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования положительно отобранные клетки будут находиться в верхней части суспензии со снятыми микропузырьками авидина, а остальные невыбранные клетки будут находиться в ячейке гранулы в нижней части трубки. Используя девятидюймовую стеклянную пипетку, вставьте наконечник под слой пузырьковой ячейки в нижнюю часть трубки.
Аспирируйте ячейку гранулы и субнатант электронной пипеткой и перенесите их в новую трубку. Повторно суспендировать слой пузырьковых клеток, оставшийся в исходной трубке, в одном миллилитре полной Т-клеточной среды. Центрифугируйте субнатант при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре и используйте его для косвенного измерения чистоты и восстановления.
После центрифугирования субнатантных и невыбранных клеток аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре среды перед подсчетом. Используя автоматизированный счетчик клеток, подсчитайте ячейки в субнатанте с помощью яркой полевой микроскопии и определите количество клеток, захваченных в слое пузырьковых клеток, как описано в текстовой рукописи. Чтобы создать конъюгированный анти-CD28 удаленный авидин и микропузырьки, добавьте биотинилированное анти-CD28 антитело к коммерческим микропузырькам и перемешайте с использованием сквозного вращения в течение как минимум двух часов.
Добавьте анти-CD28 конъюгированные стрептококковые микропузырьки авидина к приготовленной суспензии пузырьковых клеток в соотношении 1,5 к 1. Смешайте компоненты, используя сквозное вращение в течение 15 минут. Затем отрегулируйте общий объем до 2 миллионов клеток на миллилитр с полной Т-клеточной средой или другой желаемой средой в соответствии с полученным числом клеток.
Распределите один миллилитр активированных клеток в 24-луночной пластине и инкубируйте в увлажненном 5%-ном инкубаторе углекислого газа при 37 градусах Цельсия. Через 24 часа добавляют IL-2 и растворимый анти-CD3, чтобы стимулировать дальнейшее расширение, рассчитанное с использованием начального числа клеток, покрытых на нулевой день. Поместите клеточную пластину обратно в увлажненный инкубатор углекислого газа и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия.
Удаляйте половину среды из миднатанта каждые два дня. Замените его свежей, полной Т-клеточной средой и добавьте IL-2 в концентрации 50 единиц на миллилитр. Подсчитывайте Т-клетки два раза в неделю, чтобы оценить плотность клеток.
Когда плотность клеток превысит 2 раза 10 к 6-й, или в 2,5 раза 10 к 6-й клетке на миллилитр, переведите их в более крупный сосуд, разбавив их до 5 раз 10 до 5-й клетки на миллилитр. Аккуратно перемешайте содержимое каждой лунки, пипетируя вверх и вниз. Удалите все содержимое лунки, включая микропузырьки, и переложите их в 1,5-миллилитровую трубку.
Промойте каждую лунку 400 микролитрами DPBS без кальция и магния и переложите раствор в 1,5-миллилитровую трубку. Затем центрифугируют трубку при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу ячейки в 50 микролитрах разделительного буфера.
Затем разделите 50 микролитров клеточной суспензии на 25 микролитров каждый для активации и истощения. Окрашивают клетки коктейлем с активацией и истощением антител, окрашивающим коктейль, и инкубируют их в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Добавьте один миллилитр разделительного буфера, аккуратно перемешайте и центрифугируйте, чтобы вымыть лишние антитела.
Аспирировать супернатанта полностью. Повторно суспендируют ячейку гранулы в одном миллилитре сепарационного буфера и перенесут ее в соответствующий сосуд для анализа проточной цитометрии. Увеличение числа жизнеспособных Т-клеток и трансген-положительных Т-клеток наблюдалось между контрольным образцом и клетками, которые получали костимуляцию микропузырьков.
Увеличение популяций эффекторных клеток также наблюдалось в образцах микропузырьков. Жизнеспособные активированные Т-клетки экспрессируют повышенный маркер ранней активации CD69 и маркер средней и поздней активации CD25. Общее количество и процент маркеров истощения PD1-положительных клеток также были значительно выше в образцах клеток, которые получили микропузырную костимуляцию.
Правильное смешивание и дозирование микропузырьков имеет важное значение для обеспечения точного дозирования, так как микропузырьки быстро всплывают на поверхность без перемешивания. Мы полностью ожидаем, что это произойдет, обеспечив быстрый рост большой популяции Т-клеток с более высокой активностью, чем те, которые более истощенные Т-клетки часто наблюдаются в других методах.
