НВЛ привлекли к себе внимание в последнее время, но количественная оценка НВЛ in vivo оказалась сложной задачей. Этот протокол представляет собой желательный, высокочувствительный и ценный метод для исследования характеристик НЭО в клинических условиях. Этот метод следует распространить на оценку тяжести сепсиса или септического ОРДС, острого респираторного дистресс-синдрома.
Широко признано, что регулирование свалок или молекулярных паттернов, связанных с повреждением, является ключом к улучшению клинического состояния сепсиса. Самым большим преимуществом этого метода является точное количественное определение циркулирующих остатков НВЛ, таких как ДНК миелопероксидазы и ДНК нейтрофильной эластазы, за короткое время. Рекомендуется отжимать образцы перед анализом и избегать повторного размораживания.
Важно соблюдать сроки инкубации, указанные в протоколе. Начните с разведения свежеизолированных полиморфноядерных нейтрофилов до 10 000 клеток на миллилитр в RPMI 1640, не содержащем фенола красного. Просейте их в 35-миллиметровую посуду для культур.
Чтобы индуцировать нейтрофильные внеклеточные ловушки или НВЛ, сначала стимулируют полиморфноядерные нейтрофилы 25 наномолярными ПМА. Затем частично переваривают внеклеточные ловушки, добавляя 0,6 микрограмма на миллилитр ДНКазы I, и инкубируют смесь в течение 50 минут при комнатной температуре. Теперь добавьте пятимиллимолярную ЭДТА, чтобы остановить активность ДНКазы, и соберите среду, содержащую синтезированные НВЛ.
Центрифуга для удаления клеточного мусора. Соберите надосадочную жидкость из четырех здоровых контрольных групп. Перемешайте, храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования.
Пипетку 100 мкл разбавленной антимиелопероксидазы, содержащей 0,05 мкг антитела, в ИФА-планшет. Теперь накройте планшет клейкой пластиковой крышкой, чтобы предотвратить испарение образца, и инкубируйте образец в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы обеспечить связывание захваченных антител. На следующий день разбавленный раствор антител выбросьте из лунок, а в каждую лунку запипеткой закапайте 300 микролитров промывочного раствора.
Постучите по тарелке насухо бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки PBS. Закройте каждую лунку пластины 200 микролитрами блокирующего буфера. Накройте его клейкой пластиковой крышкой и закройте лунки, инкубируя его.
Выбросив блокирующий раствор из лунок и промыв пластину три-четыре раза, постучите ее насухо бумажным полотенцем. Далее пипеткой закапывают 25 микролитров плазмы во все лунки, кроме заготовки. И разбавляем его 75 микролитрами ПБС, делая окончательный объем лунки 100 микролитров.
Затем добавьте в лунку заготовки 100 микролитров ПБС. Смешайте образцы, поместив пластину на шейкер на 10 секунд при 250 об/мин при комнатной температуре. Добавьте два микролитра 100 полностью разбавленной ДНКазы I во все лунки и поместите запечатанную пластину на шейкер на 10 секунд, чтобы тщательно перемешать образцы.
Выдерживать 15 минут при комнатной температуре. Добавьте один микролитр 0,5 молярной ЭДТА в каждую лунку, чтобы остановить реакцию ДНКазы. Затем поместите запечатанную пластину на шейкер на 15 секунд, чтобы тщательно перемешать образцы.
Наконец, инкубируйте планшет в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы позволить белковым компонентам НВЛ прикрепиться к захватным антителам. На следующий день выбросьте раствор из лунок. После многократной промывки лунок пипеткой 100 микролитров разбавленного пероксидазы-конъюгированного антитела к обнаружению ДНК в каждую лунку.
Выдержите планшет в течение 1 1/2 часа, а затем выбросьте раствор в лунки. После трехкратной промывки лунок в каждую лунку закапать пипеткой 100 микролитров раствора субстрата АБТС, а запечатанную пластину инкубировать на шейкере в темноте. Остановите реакцию, добавив 50 микролитров двухмолярной серной кислоты.
Перемешайте содержимое лунки, осторожно постукивая по стенкам тарелки. Далее подключите считыватель микропланшетов к компьютеру и запустите программное приложение. В строке состояния создайте новый эксперимент и присвойте ему имя.
Затем задайте параметры считывания пластины, выбрав Absorbance (Поглощение) в качестве типа считывания, Endpoint (Конечная точка) в качестве режима чтения и two (Длина) в качестве длины волны. Затем установите лямбда-единицу равной 405 нм, лямбда-2 — 490 нанометров. Теперь выберите состояние «Выкл.» для автомикса и гашения, оставив автокалибровку включенной.Затем выберите «Читать всю пластину» в разделе «Полоски».
Наконец, установите Приоритет длины волны столбца с Нормальным в качестве Скорость каретки, а затем выберите Выкл в разделе Авточтение. Поместите пластину в ящик для инструментов и закройте ее. Нажмите «Прочитать», чтобы табличка была прочитана немедленно.
Считайте поглощение каждой лунки на длине волны 405 нм и выполните автоматическое вычитание поглощения среды анализа из всех неизвестных образцов. Достоверные стандартные градуировочные кривые были получены как для MPO-ДНК, так и для NE-ДНК, когда значения абсорбции не превышали 0,93 и 0,9 соответственно. Наибольший ОД был получен при применении 0,6 мкг на миллилитр ДНКазы I.
Коэффициенты межтестовой вариабельности комплексов в здоровых контрольных группах составили 1,871 и 0,987 соответственно, в то время как у пациентов с COVID-19 коэффициенты вариабельности составили 2,532 и 2,010 соответственно. Средние коэффициенты межтестовой вариабельности для МПО-ДНК и НЭ-ДНК составили 6,524 и 4,389 соответственно. Специфичность захватных антител к комплексам MPO-ДНК и NE-ДНК показала, что контрольные антитела изотипа слабо реагировали на комплексы.
Процентное содержание обоих комплексов было выше в плазме крови пациентов с COVID-19 по сравнению со здоровыми контрольными группами. Время расщепления ДНКазы должно быть оптимизировано, в противном случае чрезмерное переваривание снизит абсорбцию.
