Культивирование клеток является деликатным навыком, необходимым для выращивания различных типов клеток и тканей в контролируемых лабораторных условиях. Основной проблемой при выполнении работы с клеточными культурами является загрязнение. Это загрязнение может проявляться в виде бактерий, плесени или микоплазмы.
Методы и практики, описанные в этом видео, гарантируют, что ваши клетки останутся жизнеспособными, здоровыми и свободными от загрязнения. Эти методы должны строго соблюдаться, и весь персонал лаборатории должен проходить обучение не реже одного раза в год. Перед началом работы наденьте чистый лабораторный халат, предназначенный для использования только в помещении для клеточных культур.
Наденьте новые перчатки, которые не касались других поверхностей. Убедитесь, что перчатки плотно прилегают. Лучше всего подойдут перчатки без нитриловой пудры.
Лабораторный халат и перчатки не обязательно должны быть стерильными. Чтобы подготовиться к работе, распылите перчатки, рукава лабораторного халата и внутреннюю часть шкафа биологической безопасности 70%-ным этанолом. Распылите на рабочую поверхность, боковые стороны, заднюю часть, любые предметы в шкафу и переднюю стеклянную панель, как изнутри, так и снаружи.
Рабочую поверхность и стеклянную панель насухо протрите безворсовым бумажным полотенцем. Потратьте некоторое время, чтобы организовать рабочее пространство внутри шкафа. Держите водяные бани в помещении для культивирования клеток и используйте их только для целей культивирования клеток, таких как согревающие среды или размораживающие клетки.
Водяные бани следует сливать и мыть раз в неделю. Ограничьте количество предметов, вносимых в шкаф, и не прерывайте воздушный поток внутри шкафа биологической безопасности, блокируя переднюю или заднюю решетки. Опрыскайте все предметы, помещенные внутрь шкафа, 70% этанолом и вытрите их насухо.
Начните с распыления на верхнюю часть флакона носителя и двигайтесь вниз. Чистым бумажным полотенцем начните с верхней части флакона носителя, чтобы вытереть его насухо, постепенно продвигаясь ко дну. Не поднимайтесь обратно к колпачку.
Принцип работы этих шкафов заключается в том, что они вытягивают воздух из комнаты и самого шкафа через переднюю и заднюю решетки. Воздух направляется к задней части шкафа и вверх. Там загрязненный воздух проходит через кучу фильтров, а часть отфильтрованного чистого воздуха выталкивается на рабочую зону шкафа.
Если шкаф достаточно велик для размещения серологических пипеток, их можно поместить внутрь, в противном случае их можно хранить в розетке, установленной снаружи шкафа. Перед использованием рекомендуется проверить обе стороны закрытой пипетки на наличие отверстий, разрывов или проколов в упаковке. Не срывать обертку.
Вместо этого аккуратно очистите концы обертки. Вставьте серологическую пипетку в пипетку и снимите обертку одним жидким движением. Не нависайте над открытыми бутылками или флягами.
Не рекомендуется протягивать руку над открытой бутылкой или колбой или работать над открытыми колбами. Воздушный поток внутри шкафов давит на все, что находится внутри. Протянув руку, вы позволите своему рукаву или перчатке оказаться поверх предметов, которые потенциально могут вытолкнуть любое загрязнение, присутствующее на рукаве, например, в вашу клеточную культуру.
По возможности не наливайте жидкости. Вместо этого добавьте их с помощью серологической пипетки. Тщательно перемешайте содержимое и инициируйте бутылку.
Запишите, чем дополнены СМИ. Если вы работаете с прилипшими культурами и вам нужна пластиковая колба, то опрыскайте всю упаковку и положите ее внутрь. Каждый раз, когда ваши перчатки высыхают, снова опрыскивайте их этанолом.
При работе с адгезивной клеточной линией используйте автоклавные стеклянные пипетки или одноразовые стерильные пластиковые пипетки для аспирации среды или моющих растворов. Осторожно снимите металлический колпачок с контейнера для хранения. Изолируйте одну стеклянную пипетку, осторожно встряхнув емкость под углом.
Залезая в контейнер, не прикасайтесь к другим пипеткам. Обрабатывайте выбранную пипетку только с одного конца. Быстро замените крышки на бутылках и колбах как можно скорее.
Положите колпачки на рабочую поверхность вверх ногами так, чтобы обод не касался рабочей поверхности. Не хватайтесь за колпачок сверху или снизу. Вместо этого прикасайтесь к колпачкам с боков.
При аспирации жидкостей используйте колбу-ловушку, расположенную снаружи шкафа во вторичном контейнере на полу. Отходы будут создаваться во время работы внутри шкафа. Поскольку слишком частое перемещение рук внутрь и наружу шкафа прервет поток воздуха, можно временно оставить любые отходы внутри шкафа.
Отложите его в сторону, чтобы он не мешал вашей работе. Обильно сбрызгивайте перчатки 70% этанолом каждый раз, когда они высыхают. Потрите руки друг о друга, чтобы они не капали мокрыми.
Небольшое замечание о серологических пипетках. Если они случайно задели что-то еще в капюшоне, не стесняйтесь их выкинуть. Лучше всего начать все заново с чистой серологической пипетки, а не использовать ту, которая может быть загрязнена.
Перед помещением клеток в инкубатор проверьте, как они выглядят под микроскопом. Следует наблюдать единичные клетки. Это указывает на то, что клетки были полностью ресуспендированы.
Не говорите, не чихайте, не кашляйте и не дышите тяжело в инкубаторы. Быстро открывайте и закрывайте дверцы инкубатора. Если оставить их открытыми дольше, чем необходимо, это может привести к попаданию загрязняющих веществ, присутствующих в воздухе, в инкубаторы.
Убедитесь, что крышки на всех бутылках тщательно закрыты, прежде чем вынимать их из шкафа. Носители чувствительны к свету. Его следует хранить в темноте при температуре четыре градуса Цельсия, когда он не используется.
После завершения работы по культивированию клеток снова опрыскайте внутреннюю часть шкафа 70% этанолом и вытрите поверхность насухо бумажным полотенцем. Опорожните мешок для биологически опасных отходов. Повторите этот процесс и замените перчатки при переходе на другую клеточную линию.
При работе с суспензионными культурами, выращенными в стеклянных колбах, следите за тем, чтобы перчатки были влажными. Прикоснитесь к алюминиевой фольге влажными перчатками, а затем распылите только на дно колбы, прежде чем помещать ее в шкаф биологической безопасности. При взятии образца для подсчета клеток извлеките из контейнера только одну пробирку объемом 1,5 мл.
Не прикасайтесь к другим трубкам. Поместите колпачок вверх дном на рабочую поверхность. Не прикасайтесь к внутреннему ободу.
Обращайтесь с ним осторожно по бокам и замените его, как только закончите. При работе с ячейками подвески и стеклянными колбами осторожно снимите сложенный вдвое кусок алюминиевой фольги, который покрывает всю горловину колбы. Аккуратно потяните за все четыре угла и положите фольгу вверх дном на рабочую поверхность.
Обрабатывайте стеклянную колбу только снизу. Не прикасайтесь к нему с шеи, как только фольга снята. Используйте серологическую пипетку объемом 1 мл, чтобы взять образец для подсчета клеток.
Не допускайте стекания носителя по стенкам колб. Если это так, сбрызните бумажное полотенце 70% этанолом и сразу же очистите его. Убедитесь, что крышки или алюминиевая фольга затянуты, прежде чем вынимать бутылки или колбы из шкафов биологической безопасности.
Используйте отдельные инкубаторы для разных типов клеток. Это предотвратит перекрестное загрязнение разных типов клеток. Рекомендуется размещать колбу вакуумной ловушки для сбора жидких отходов снаружи шкафа на полу во вторичном контейнере с маркированными отходами.
Шланг подключается к фильтру, который заменяется ежемесячно. Шланг проходит через боковую часть шкафа. Уберите биологически опасный мусор после завершения работы.
Держите протокол мытья стекла на стене у раковины. Сначала замочите выброшенные клетки 10%-ным отбеливателем примерно на пять минут. Затем выбросьте отбеливающую смесь и тщательно промойте колбу водой.
Добавьте мыло с водой, очень хорошо потрите его щеткой, смойте еще водой. И последний шаг - ополоснуть стеклянную посуду водой DI на кране справа. Как можно скорее вымойте стеклянные колбы, хорошо потрите стеклянную посуду.
Клетки Sf9 покинут этот край мертвых клеток, если его не очистить должным образом. Используйте эти колбы только для культивирования клеток, стеклянной посуды для клеточных культур в автоклаве вместо того, чтобы отправлять ее на мойку стекла. Используйте вакуумный цикл на автоклаве в течение 40 минут стерилизации и 40 минут высыхания.
Храните его отдельно от стеклянной посуды в основной зоне лаборатории. Организуйте комнату клеточных культур таким образом, чтобы все расходные материалы располагались в одной зоне, тем самым сводя к минимуму необходимость для сотрудников лаборатории выходить из комнаты клеточных культур в поисках расходных материалов. Маркируйте любые пластиковые бутылки, используемые для сбора клеток и впоследствии повторно используемые в клеточных культурах, только для использования в клеточных культурах.
Используйте специальные флаконы для клеточных культур для одного конкретного типа клеток. Храните эти бутылки в помещении для культивирования клеток для легкого доступа. Для культур, которые выращиваются в суспензии, плесень будет распознаваться как плавающие шарики в средах.
Что касается бактериального загрязнения, то оно сделает среду белой и мутной. Точно так же для адгезивных клеток загрязнение плесенью можно легко распознать как нечеткие пятна. Бактериальное загрязнение превратится в обычно прозрачную среду, белую и мутную.
Многие виды микоплазмы могут быть надежно идентифицированы с помощью анализа на основе ПЦР. Полоса слева показывает стандарты молекулярной массы для ДНК. Четыре полосы справа являются положительными элементами управления.
Полосы не появляются под тестируемыми типами клеток, потому что микоплазма не была обнаружена. Среды для культивирования клеток изменят цвет с красного на желтый, если присутствуют индикаторы pH. Желтый цвет указывает на низкий рН, и носитель следует заменить.
Если при подсчете клеток под световым микроскопом наблюдаются другие наросты или формы клеток, то это может быть индикатором загрязнения. Обратите внимание, что перед подсчетом клеток следует провести тщательную очистку гемоцитометра, так как этот тип мусора может присутствовать только на гемоцитометре, а не в самой культуре клеток. Хотя загрязнение является одной из основных проблем при выполнении работы с клеточными культурами, эти риски можно смягчить, следуя методам и методам, описанным в этом видео.
Если ежемесячный тест на микоплазму проводится каждый месяц, персонал лаборатории ежегодно проходит обучение и строго соблюдает эти методы, то ваши клетки останутся здоровыми и свободными от загрязнения. Это также поможет снизить затраты, связанные с покупкой дорогостоящих сред для культивирования клеток, покупкой новых клеток, а также сократит время простоя обеззараживания инкубатора. Помните, что ключом к успешному культивированию клеток являются ранние действия, чтобы предотвратить заражение в первую очередь.
