Этот протокол представляет собой функциональный анализ in vitro с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота, для измерения иммуногенности вакцины перед исследованиями in vivo. Таким образом, восполнение существующего пробела в вакцинологии скота. Это генерация и применение дендритных клеток.
Как наиболее мощные антигенпрезентирующие клетки, дендритные клетки стали ключевой целью исследований для понимания внутриклеточных иммунных механизмов, включая эффективность вакцины. Этот анализ может быть реализован в качестве инструмента для скрининга вакцин-кандидатов, в качестве состояния контроля качества для производства вакцины, а также для отбора антигена и адъюванта. Продемонстрирует процедуру Ричард Кангете, ученый из лаборатории животноводства и здоровья.
Начните с инвертирования и смешивания крови, полученной из пункции яремной вены теленка, с гепаринизированными вакутейнерами. Затем переведите 20 миллилитров гепаринизированной крови в стерильную 50-миллилитровую пробирку и разбавьте ее 10 миллилитрами фосфатного буферного физиологического раствора или PBS. Пипеткой 15 миллилитров выделительной среды лимфоцитов в стерильную 50-миллилитровую пробирку и наклоните пробирку в положение 45 градусов.
Аккуратно наложите 30 миллилитров среды PBS крови поверх выделения лимфоцитов с помощью 25-миллилитровой пипетки и медленно верните пробирку в вертикальное положение перед центрифугированием. Затем соберите тонкий белый слой мононуклеарных клеток периферической крови или слой PBMC с помощью пипетки Пастера и перенесите его в новую 50-миллилитровую пробирку. Вымойте собранные PBMC два раза, используя 40 миллилитров PBS на стирку, и тщательно перемешайте.
После центрифугирования ресуспендируйте гранулу в 15 миллилитрах буфера калия хлорида аммония или буфера ACK. После 10-15 минут инкубации при комнатной температуре добавьте до 40 миллилитров PBS и центрифугируйте пробирку с максимальным ускорением и замедлением. Ресуспендировать гранулу в 10 миллилитрах полной питательной среды.
Затем добавьте пять микролитров буфера CD14 MicroBead на 10 миллионов клеток и тщательно перемешайте с помощью пипетки. Для анализа проточной цитометрии добавьте 10 микролитров изотиоцианата флуоресцеина CD14 или окрашивающего антитела FITC к PBMC и инкубируйте его в течение 15 минут при температуре от четырех до восьми градусов Цельсия, прежде чем приступить к проточной цитометрии. К неокрашенным PBMC добавьте один миллилитр факсимильного буфера и центрифугируйте его в течение семи минут при 500 г и четырех градусах Цельсия.
Затем ресуспендируют гранулу в 500 микролитрах факсимильного буфера на 100 миллионов ячеек. Затем вставьте колонку для разделения иммуномагнитных клеток в сепаратор и поместите 50-миллилитровую сборную трубку под выходное отверстие колонки для сбора проточного потока. После промывки колонки одним миллилитровым дегазированным факсимильным буфером замените использованную 15-миллилитровую трубку новой.
Пипетка сотня миллионов клеток в 500 микролитров буфера за раз, позволяя клеточной суспензии проходить через колонку. Затем каждый раз трижды промывайте колонку тремя миллилитрами дегазированного факсимильного буфера. После сбора проточной части пометьте первую элюированную наивную фракцию лимфоцитов как фракцию CD14-отрицательных клеток.
Снимите колонну с сепаратора и поместите новую стерильную 15-миллилитровую пробирку под колонку для сбора сточных вод. Добавьте пять миллилитров факсимильного буфера в столбец и сразу же протолкните его с помощью поршня. Соберите и пометьте вторую проточную или наивную фракцию моноцитов как фракцию CD14-положительных клеток.
Добавьте полную питательную среду к собранным CD14-положительным моноцитам, чтобы получить 1 миллион клеток на миллилитр. Затем добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку стерильной 24-луночной пластины, прежде чем дополнить каждую лунку 40 микролитрами цитокинового коктейля, входящего в комплект. На второй день переложите половину содержимого каждой лунки в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра с помощью пипетки.
После центрифугирования 1,5-миллилитровых пробирок по 500 г в течение семи минут выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 500 микролитрах свежей полной питательной среды. Перенесите 500 микролитров этой ресуспендированной клеточной суспензии обратно в соответствующие лунки так, чтобы конечный объем в лунке стал одним миллилитром. Обогатите каждую лунку 20 микролитрами цитокинового коктейля.
Чтобы получить импульсные антигенные MoDC, добавьте один микролитр на миллилитр вакцины против вируса бешенства или суспензии RV к одному миллилитру наивной культуры MoDC в 24-луночном планшете и инкубируйте планшет в течение 48 часов при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия. На седьмой день держите 24-луночную пластину, содержащую антиген-импульсные MoDC, на льду в течение 10 минут, прежде чем добавить один миллилитр ледяного PBS на лунку и тщательно перемешать. Перенесите суспензию в 15-миллилитровую трубку.
Промойте лунки двумя миллилитрами ледяного PBS. Соберите остаточные ячейки в каждой лунке и перенесите промытое содержимое в соответствующие пробирки. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 г в течение семи минут.
После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу клеток MoDCs, импульсированную антигеном, в полной питательной среде, чтобы отрегулировать конечную концентрацию 100 000 клеток на миллилитр. Для совместной культуры MoDC-лимфоцитов засейте лунки стерильной 24-луночной пластины одним миллилитром суспензии наивных лимфоцитарных клеток и одним миллилитром суспензии MoDC, импульсированной или неантиген-импульсной, на седьмой день импульса антигена. После двух дней инкубации дополните каждую лунку 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного интерлейкина-2 и продолжайте инкубацию еще 120 часов.
На 14-й день перенесите один миллилитр кокультуры в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте пробирку. Затем ресуспендируют клеточную гранулу одним миллилитром антиген-импульсных или неимпульсных MoDC. Хорошо перемешайте и переложите клеточные суспензии в соответствующие лунки.
После окрашивания клеточной поверхности PBMC и наивных лимфоцитов и моноцитов перенесите один миллилитр клеточной суспензии в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитра с помощью пипетки и центрифуги в течение 10 минут при 500 г. Затем ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS и переложите ее в 15-миллилитровую пробирку. Также соберите остаточные ячейки и соответствующие пробирки, используя один миллилитр PBS.
Затем добавьте 10 миллилитров PBS в 15-миллилитровую пробирку, содержащую клетки, и перемешайте пипеткой. После центрифугирования пробирки в течение семи минут при 850 г удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу клетки с остаточной суспензией, оставшейся после декантации надосадочной жидкости. Перенесите суспензию ячейки на пластину с V-образным дном на 96 лунок и загерметизируйте лунки, чтобы избежать просыпания.
После завершения окрашивания выполните анализ проточного цитометра. В предварительном просмотре в реальном времени отрегулируйте порог флуоресценции, включая напряжение и усиление, а также размер ячейки, чтобы в конечном итоге нарисовать ворота вокруг желаемой популяции клеток, исключив при этом любой клеточный мусор. Окрашивание клеток CD14 и проточная цитометрия показали, что наивная фракция моноцитов содержала 98% CD14-положительных моноцитарных клеток и функционально способна к поглощению антигена.
Наивные MoDCs, фенотипически охарактеризованные оценкой экспрессии MHC класса 2 и костимулирующих маркеров клеточной поверхности CD86 и CD40, подтвердили дендритные клетки или DC-подобный фенотип. Во время совместного культивирования лимфоцитов MoDC на девятый день в импульсе RV к MoDC наблюдалось морфологическое изменение, свидетельствующее о расширении дендритов. По сравнению с неимпульсной культурой лимфоцитов MoDC достоверное увеличение пролиферации лимфоцитов было продемонстрировано за счет повышения регуляции маркеров активации Ki67 и CD25 на CD4-положительных и CD8-положительных Т-клетках на 16-й день в импульсной кокультуре лимфоцитов MoDC.
CD8-положительные Т-клетки из зрелых импульсных кокультур MoDC RV продемонстрировали восьмикратное повышение регуляции Ki67 по сравнению с неспецифической группой. CD4-положительные клетки в одной и той же совместной культуре показали семикратное увеличение Ki67 по сравнению с контрольной группой, демонстрируя способность МДК, праймированных ПЖ, представлять антиген РВ наивным лимфоцитам и активировать их в условиях in vitro. Количественное определение кПЦР кокультур показало увеличение экспрессии гамма-интерферона более чем на 30% и увеличение экспрессии Ki67 более чем на 5% во всех кокультурах с использованием GAPDH в качестве калибратора.
Значительно более высокая концентрация секретируемого гамма-интерферона наблюдалась в импульсной культуре лимфоцитов MoDC RV по сравнению с группой неспецифического лечения. Выполняйте этап наслоения очень медленно и осторожно, следя за тем, чтобы кровь укладывалась поверх среды для выделения лимфоцитов. Будьте особенно осторожны, чтобы собрать все PBMC, не собирая слишком много материала с других слоев.
Другие методы, такие как проточная цитометрия, ИФА и количественная ПЦР, среди прочего, могут быть применены после этой процедуры для оценки активации иммунных маркеров.
