Инструменты редактирования генома на основе CRISPR значительно облегчили создание генно-инженерных моделей репостов. Система CRISPR состоит из одного направляющего комплекса РНК к нуклеазе Cas9 и может быть запрограммирована на нацеливание на интересующую последовательность в геноме для создания двухцепочечного разрыва ДНК. Благодаря совместной доставке шаблона репарации ДНК этот разрыв ДНК может быть точно восстановлен вместе с добавлением любой желаемой сконструированной последовательности ДНК с помощью процесса, называемого гомологической направленной репарацией.
Именно с помощью этого процесса мы можем создавать модели крыс с целевыми вставками или заменами ДНК. Используя этот протокол, мы представляем модифицированный подход с использованием аденоассоциированного вируса для доставки матрицы репарации ДНК к эмбрионам крыс, а также последующей доставки комплексов CRISPR Cas9 через электропорацию двух клеточных эмбрионов. Серотипы AAV 1 или 6 упакованы в модифицированный шаблон репарации ДНК, предназначенный для интеграции в геном крысы с помощью CRISPR-опосредованного процесса направленной репарации гомологий.
AAV добавляют в 30 микролитров крысиной среды KSOM в конечной концентрации 3 X 10 до 7-й геномной копии на микролитр. Затем свежесобранные эмбрионы одной клеточной стадии с видимыми пронуклеусами переносятся на среду, содержащую AAV, что позволяет осуществлять вирусную трансдукцию. Используя наш протокол, нет необходимости истончать zona pellucida, так как серотипы AAV 1 и 6 способны легко проходить через него для эффективной доставки шаблона репарации ДНК.
Эмбрионы культивируются с помощью AAV в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и максимальной влажностью. На следующий день делают электропорационную смесь, содержащую сто нанограммов на микролитр однонаправляющей РНК и сто нанограммов на микролитр белка Cas9, разведенного в среде OptiMIM. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут для образования комплексов CRISPR RNP.
Во время инкубации включается электропоратор и провода прикрепляются к стеклянным предметным электродам. После завершения формирования РНП между электродами пипетируется пять микролитров электропорационной смеси, следя за тем, чтобы в раствор не попадали пузырьки воздуха. Эмбрионы, находящиеся теперь на стадии двух клеток, извлекаются из среды, содержащей AAV, и осторожно перемещаются в электропорационную смесь между электродами.
Эмбрионы выравниваются, гарантируя, что ни один из них не соприкасается ни с одним из электродов, так как это вызовет лизис во время электропорации. Вот как выглядит эта процедура под микроскопом. Также важно отметить, что импеданс будет уменьшаться по мере увеличения объема между электродами.
По этой причине, а также для того, чтобы не разбавлять электропорационную смесь, вместе с эмбрионами следует переносить минимальное количество сред. Далее импеданс измеряется нажатием кнопки с символом ома. Импеданс должен быть в пределах от 0,18 до 0,3 Ом.
Если в радиусе действия, электропорация запускается нажатием кнопки пуска. Этот процесс занимает всего пару секунд, и вот как он выглядит под микроскопом. Вы заметите, что на каждом электроде быстро образуются пузырьки.
Сразу после электропорации эмбрионы извлекают из предметного стекла и трижды промывают в свежей крысиной среде KSOM. Затем эмбрионы могут быть культивированы для исследований in vitro или перенесены суррогатным самкам для получения живого потомства. Важно отметить, что опухание эмбриона является обычным явлением после электропорации.
Эта припухлость должна сойти через несколько часов после посева культуры. Также часто наблюдаются события клеточного слияния в 20% двух клеточных эмбрионов после электропорации. Слияния клеток, как правило, можно избежать путем тщательного горизонтального выравнивания осей эмбрионов между электродами.
Тестирование нашего протокола на эмбрионах крыс и скрининг культивируемых бластов для вставки сконструированной короткой искусственной последовательности интронов, содержащей два сайта loxP. Мы отметили, что более 60% бластоцист содержат правильно таргетированный аллель нокаута, основанный на анализе последовательностей нового поколения. Далее, продолжая тестировать наш протокол для получения живых крыс с нокаутированием, мы разрабатываем проект по разработке последовательности покрытия Cre-рекомбиназой, нацеленной на стартовый сайт ATG гена DRD2 крысы.
Из 11 родившихся потомков 10 были положительными с помощью ПЦР-анализа в пяти группах прайм-гомологий, трех группах прайм-гомологий и внутреннем ПЦР-анализе для выявления Cre-рекомбиназы. Подводя итоги семи различных проектов, мы достигли 76%-го среднего показателя успешности нокаутирования у животных-основателей, что было определено с помощью ПЦР-анализа по гомологическим соединениям рук и верификации последовательности ДНК. Используя эту AAV-опосредованную доставку ДНК и конвейер электропорации двух клеточных эмбрионов, мы добились значительно более высокой эффективности вставки, чем традиционные подходы для вставок ДНК длиной до трех килобайт.
Также важно отметить, что, хотя мы продемонстрировали использование этой процедуры на эмбрионах крыс, она может быть эффективно применена и к другим видам для генерации целевых вставок ДНК.
