Наш протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователям, работающим над не-моделью грибов, возможность установить передовые технологии редактирования генома в своих лабораториях. Поскольку он не опирается на существующие методы, такие как системы выражения, этот протокол имеет то преимущество, что его легче установить в не моделных системах. Этот метод может быть использован в различных видах грибов и может быть использован для выяснения функций генов, участвующих в пути спаривания, роста и патогенности.
Таким образом, при выполнении этой процедуры, нужно быть уверенным, что достаточно дней подряд, чтобы конкурировать с протоколом, как Есть только несколько моментов в эксперименте, на котором он может быть приостановлено. Для сбора конидии, фильтровать жидкую культуру через слой стерильной лабораторной ткани в 50 миллилитров центрифуг трубки для центрифугации. Resuspend конидия гранулы в пять миллилитров воды и просматривать 10 микролитр aliquot раствора конидии под световым микроскопом на 40X увеличение, чтобы подтвердить, что только конидия были восстановлены.
Далее добавьте 200 миллилитров свежего 1%солодового экстрактного бульона в 500-миллилитровую колбу и перенесите весь объем конидии в колбу. Затем инкубировать жидкой культуры на срок до 12 часов в 25 градусов по Цельсию встряхивания инкубатор на 120 оборотов в минуту. Чтобы собрать зародыши, перенесите культуру на 50 миллилитровых центрифуг для центрифугации и усыпляют пророщения до 10 миллилитров одного молярного сорбитола.
Добавьте один миллилитр прорастающий раствор в различные концентрации ферментного раствора и инкубировать раствор фермента споры в течение двух-трех часов в трясущимся инкубаторе при 80 революциях в минуту. Для сбора протопластов отфильтруй ферментный раствор через слой стерильной лабораторной ткани и соберите протопласты путем центрифугации. Затем тщательно перепрополировать протопласт гранулы в 200 микролитров буфера STC и проверить 10 микролитера aliquot раствора под микроскопом, чтобы подтвердить, что только протопласты были восстановлены.
Чтобы начать преобразование, объединить примерно пять раз от 10 до шести протопластов с одним объемом раствора рибонуклеопротеина и примерно шесть микрограммов фрагмента донорской ДНК. Затем используйте пипетку, чтобы медленно и равномерно капать один миллилитр свежеприготовленного раствора 30%PTC на протопластовую подвеску, чтобы создать гидрофобный слой над протопластами и инкубировать раствор в течение 20 минут при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте пять миллилитров осмотической среды управления к протопластовой подвеске, медленно и мягко перемешивая раствор.
После смешивания инкубировать раствор протопласта в трясущимся инкубаторе на 80 оборотов в минуту за одну ночь. На следующее утро разделите раствор между пятью 60-миллиметровыми культурными пластинами. Добавьте 10 миллилитров осмотического контроля среднего агара, дополненного 30 микрограммами на миллилитр гигромицина B к каждой пластине и медленно поверните каждую пластину, чтобы смешать.
Разрешить первый слой агара установить перед добавлением 10 миллилитров осмотического контроля среднего агара дополняется 40 микрограмм на миллилитр гигромицина B по две пластины. После разрешения второго слоя агара установить, инкубировать культур на 25 градусов по Цельсию, пока одиночные изоляты могут наблюдаться растет через оба слоя агара. Чтобы восстановить успешно преобразованные изоляты, перенесите отдельные изоляты, способные к росту, в свежие агаровые пластины экстракта солода, дополненные 50 микрограммами на миллилитр гигамицина B.To оцените влияние целевого нарушения гена на гетероталические возможности гриба, со-прививку экстракта свежего солода агар-среды с одним мутантным штаммом, а также штаммом противоположного типа спаривания.
При работе с H.omanensis накройте крышкой, но не запечатываем пластины. Поместите тарелки при комнатной температуре в течение семи дней. В конце инкубации, визуально оценить для производства сексуальных структур.
Чтобы проверить гомоталические возможности штамма мутантов, привить свежий солодовый экстракт агар среды с мутантным штаммом интереса и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение одной недели, как попродемонстрировано. Чтобы оценить влияние нарушения на темпы роста гриба изучается, вставьте заднюю часть большой стерильной наконечник пипетки в активно растущие края культуры каждого мутанта и дикого типа штамма интерес для создания mycelial покрытые агар пробки и привить свежий солод экстракт агар среды. По крайней мере три репликации должны быть сделаны в типе культуры.
После трех дней роста при 20 градусах цельсия, измерьте рост в каждой пластине на двух перпендикулярных диаметрах. Конидия, используемая в качестве исходного материала для протокола, может прорастать и расти до тех пор, пока они не станут молодыми зародышами. Обратите внимание, что зрелые mycelial нити, такие как они слишком зрелые для деградации и не должны использоваться.
Когда клетки больше не имеют клеточных стенок, они становятся очень чувствительными к механическим нарушениям и выпускают круглые протопласты, которые могут быть собраны для преобразования. Успех протокола может быть подтвержден на фенотипический анализ штаммов мутантов. Для этого мутанта MAT 127 изолировать, вегетативные радиальные темпы роста была значительно снижена, предполагая, плейотропный эффект для нового гена спаривания.
Кроме того, мутантная изоляция была неспособна завершить половой цикл, создавая только незрелые сексуальные структуры, которые не производили сексуальных спор по сравнению с изолятом дикого типа, который завершил весь половой цикл в течение нескольких дней после инкубации. РНК очень чувствительна и очень легко деградирует. Таким образом, чистая рабочая среда и быстрое работа на льду имеют важное значение для успеха этого эксперимента.
После того, как мутант изолировать были успешно созданы, они могут быть подвергнуты фенотипического или РНК-сек анализа, как это уместно для гена характеризуется.
