Этот протокол использует CRISPR-Cas9 для создания выбить или в нокаут линий. Основным преимуществом этой техники является то, что она проста и эффективна, чтобы следовать особенно для начинающих исследователей. Для прохода клеток, лечить ночь культурных клеток с двумя миллилитров 0,25%трипсина ЭДТА на тарелку при 37 градусов по Цельсию в течение двух минут.
Когда клетки поднимаются со дна пластины, нейтрализуй энзиматические реакции двумя миллилитров клеточной культуры среды, и передать клеточной подвески в конической трубки. Соберите клетки путем центрифугации и повторно посовечите гранулы в пять миллилитров среды культуры свежих клеток для подсчета. Затем семена 1,8 раза от 10 до пятой клетки в один колодец 24-хорошо ткани культуры пластины для ночной культуры при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Для трансфекции клеток добавьте соответствующий объем трансфекции смеси, содержащей соответствующую концентрацию плазмиды CRISPR, в соответствующий объем трансфектонного реагента, в соответствии с экспериментальной конструкцией и инструкциями производителя. После инкубации трансфекции смесь при комнатной температуре в течение рекомендуемого периода времени, добавить раствор в клетки в капле мудрым образом. Затем аккуратно закружить пластину, чтобы смешать и поместить пластину в увлажненной 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа.
В конце трансфекции добавьте 150 микролитров трипсина-ЭДТА, чтобы размежевать клетки, как это было продемонстрировано, и собрать отдельные клетки путем центрифугации. Повторное распределение гранул в 2%fetal быvine сыворотки в PBS и фильтровать клетки через 30 микрометров сетки ситечко в пять миллилитров флуоресценции активированной клеточной сортировки, или FACS трубки. Затем используйте неперераженные клетки, чтобы установить отрицательные контрольные ворота на цитометре потока и сортировать трансфицированные клетки в соответствии с флуоресцентным маркером на плазмидной CRISPR, используемой для трансфекции, в трубку, содержащую 100 микролитров клеточной культуры среды.
Когда все трансфицированные клетки были собраны, гранулы клеток центрифугации на максимальной скорости и повторно гранулы в 300 микролитров клеточной культуры среды. Семя 200 микролитров клеток в один колодец 24-хорошо ткани культуры пластины и позволяют клеткам восстановить в течение нескольких дней в 37 градусов по Цельсию инкубатор. Пеллет оставшиеся 100 микролитров отсортированных клеток на максимальной скорости в течение пяти минут и извлечь геномную ДНК из полученной гранулы в соответствии со стандартными протоколами извлечения ДНК.
Далее добавьте 10 микролитров буфера полимеразной цепной реакции, один микролитр деоксинуклеотидной смеси, 2,5 микролитров определяемой пользователем обратной грунтовки, 0,5 микролитера полимеразы ДНК, два-пять микролитров извлеченного геномного шаблона ДНК и достаточное количество двух дистиллированной воды, чтобы довести реакцию до конечного объема в 50 микролитров. Запустите смесь на тепловой циклер и решить реакцию на 2%agarose гель с помощью 1X TAE буфера в соответствии со стандартными протоколами. Используйте чистый, острый скальпель, чтобы выкакотать полимеразную цепь и очистить ДНК с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с инструкциями производителя.
Измерьте концентрацию продукта с помощью спектрофотометра на 260 нанометровом абсорбировании. Подготовь анализную смесь, содержащую 200 нанограммов изолированной ДНК, два микролитров буфера реакции T7 endonuclease I и достаточное количество двойной дистиллированной воды, чтобы довести конечный объем смеси до 19 микролитров. Reanneal полимеразы цепной реакции продукта в тепловой циклер на указанные параметры и смешать пять единиц T7 эндонуклеазы I с повторного продукта в течение 50 минут инкубации при 37 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, решить переваренной ДНК на 2,5%agarose гель с помощью буфера 1X TAE, и изображение геля на соответствующую систему визуализации геля. Откройте изображение геля в ImageJ и нарисуйте прямоугольную коробку вокруг полосы как можно ближе к ее границе. Нажмите Анализ и Установите измерения, подтверждающие, что область, среднее серое значение и интегрированные параметры плотности проверяются.
Нажмите OK, и выберите Анализ, и измерения. Среднее значение, или значение плотности сырой интенсивности, свидетельствует об интенсивности полосы. Когда культурно-трансфицированные клетки начинают становиться стеченными, отсоедините их с трипсином-ЭДТА, как попродемонстрировано, и посеять клетки редко в 100-миллиметровой ткани культуры блюдо, чтобы достаточно места для отдельных колоний расти, прежде чем вернуть клетки в инкубатор культуры клеток.
Когда колонии начинают формироваться, используйте микроскоп с четырех X увеличением, чтобы выбрать отдельные колонии для передачи в отдельные колодцы 24-хорошо пластины, содержащей 500 микролитров клеточной культуры среды на скважину. Позаботьтесь о том, чтобы ваш совет не касался окружающих колоний, чтобы предотвратить смешивание колоний в отдельных колодцах или выбрать из области разреженного роста колонии. Когда все клоны были собраны, поместите пластину в инкубатор клеточной культуры до тех пор, пока культуры не станут стеченными.
Поскольку непереваренные плазмиды супер-спиральные, они, как правило, работают быстрее, чем их линейные аналоги. Чтобы определить, были ли олигонуклеотиды успешно клонированы в плазмидный хребет CRISPR, выполняется колония ПЦР и положительные клоны прививаются до того, как плазмиды извлекаются и отправляются для секвенирования Сэнгера. Флуоресцентный сигнал можно легко визуализировать под микроскопом после успешной доставки плазмидов, что позволяет трансфицированным клеткам отсортированы по цитометрии потока.
Анализ T7 endonuclease I выполняется для проверки эффективности расщепления геномной ДНК, как рассчитывается из интенсивности полос наблюдается на агарозный гель. Кроме того, если гомологический эксперимент на основе ремонта предназначен для включения места ограничения в целевой локус, анализ полиморфизма длины фрагмента ограничения может быть выполнен с соответствующим ферментом ограничения. Для дальнейшего подтверждения того, что ген кодирования белка был успешно инактивирован, западная помарка может быть проведена для обеспечения того, чтобы не было целевого белка.
Сортировка клеток после трансфекции устраняет клетки без включенной плазмиды, тем самым увеличивая процент клеток, скрининг на более поздних стадиях, как имеющие нокаут или нокаут гена. С развитием этой техники, мы теперь можем производить нокаут клеточных линий для изучения функции генов и стук в клеточных линий для моделирования конкретных заболеваний, чтобы понять их механизм.
