Наша исследовательская группа использует митохондрии в качестве фармакологической мишени для разработки различных продуктов, таких как химиотерапия, инсектициды и другие. В этом видео мы хотим описать методологию оценки ферментов митохондриального дыхания более доступным, понятным и удобным для использования способом. В нашей лаборатории мы разработали протокол для оценки различных эффектов ксенобиотиков на митохондрии у крыс, комаров и клещей, что дает некоторое представление о конкретном митохондриальном ответе.
Этот подход поддерживает разработку биобезопасных пестицидов путем выявления митохондриальных биоэнергетических нарушений, критически важных для минимизации нецелевой токсичности. Наше дифференцированное преимущество заключается в том, что протокол разработки инсектицидов начинается с анализа in silico тысяч молекул, за которым следует проверка in vitro тех молекул, которые соответствуют критериям биобезопасности, и завершается испытаниями in vivo. Этот метод экономит время и ресурсы, придерживаясь при этом лучших практик производства пестицидов.
В среднесрочной перспективе мы выберем молекулы природного происхождения, которые можно сочетать с генетической модификацией, нацеленной на митохондрии насекомых, с целью повышения специфичности и биобезопасности у нецелевых организмов. Для начала приготовьте 250 миллилитров изолирующего буфера митохондрий с 0,2 грамма БСА или без него. Влейте 10 миллилитров буфера в ледяную коническую трубку.
После усыпления крысы полностью рассеките ее печень и поместите ее в ледяной изоляционный буфер, чтобы промыть ее. После двух промываний острыми ножницами измельчите ткань печени в чашке Петри, содержащей 10 миллилитров изоляционного буфера. Поместите раствор в трубку гомогенизатора тканей Potter-Elvehjem для гомогенизации измельченной ткани не менее 10 раз с низкой скоростью 390 оборотов в минуту.
Затем перелейте гомогенизированный раствор в коническую пробирку и центрифугируйте при 600 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования осторожно перелейте надосадочную жидкость в новую коническую пробирку. Снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 7 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте выделенную митохондриальную гранулу в двух миллилитрах изоляционного буфера без БСА. Проверьте, вылупляются ли яйца Aedes aegypti в лотках с фильтрованной дехлорированной водой за неделю до эксперимента, и следите за процессом линьки у личинок. Как только личинки достигнут стадии L3, подождите максимум 12 часов, прежде чем собирать их.
С помощью пипетки Пастера соберите не менее 100 личинок Aedes aegypti на возрастах от L3 до L4 примерно в 30 миллилитрах воды, не содержащей хлора. После фильтрации переложите раствор с личинками в пробирку тканевого гомогенизатора Potter-Elvehjem и тщательно гомогенизируйте со скоростью примерно 390 оборотов в минуту не менее 10 раз. Пропустите гомогенизированную ткань через шприц из стекловаты, чтобы отфильтровать крупные остатки экзоскелета.
Для начала получите митохондрии печени крысы и гомогенизированные личинки Aedes aegypti L3, L4. Для полярографического анализа калибруйте респирометр с высоким разрешением каждый день перед началом любых анализов, следуя инструкциям производителя. Добавьте в камеры реакционную среду, обеспечив превышение не менее чем на 0,2 миллилитра сверх стандартного объема экспериментальной камеры в два миллилитра.
Контролируйте потребление кислорода для измерения активности NADH и сукцинатоксидазы после добавления реакционного буфера, 0,1 мг белка и субстрата. Подождите, пока сигнал концентрации кислорода стабилизируется, и запишите его. Добавьте в камеру ингибиторы белка переноса электронов, чтобы подтвердить, что наблюдаемое потребление кислорода обусловлено митохондриальной дыхательной цепью.
Для обеспечения активности НАДН-дегидрогеназы сначала готовят реакционную систему, содержащую все необходимые компоненты, и добавляют реагенты в ячейку спектрофотометра. Контролируйте активность NADH дегидрогеназы со снижением ферроцианида калия на 420 нанометров. Для расчета концентрации используйте коэффициент затухания моляров 1,04 на миллимоляр на сантиметр.
Наконец, разделите зарегистрированную активность на концентрацию белка, используемую для получения специфической активности фермента. Аналогичным образом оценивают активность сукцинатдегидрогеназы и цитохром с-редуктазы или комплекса III с использованием соответствующих реакционных смесей. Чтобы измерить активность цитохром-с-оксидазы или комплекса IV, подготовьте реакционную систему и смешайте равные молярные количества цитохрома с и дитионита натрия, обеспечивая полное восстановление.
Пропустите восстановленную смесь через колонку со сшитым декстраном, используя фосфатный буфер в качестве подвижной фазы. Количественное определение фракций, собранных на 550 нанометрах в спектрофотометре. Наконец, рассчитайте концентрацию с коэффициентом затухания моляров 19,8 на миллимоляр на сантиметр, применяя закон Бира.
Разделите зарегистрированную активность на концентрацию белка для получения конкретных результатов активности фермента. Кавакрол в концентрации 9,7 частей на миллион снижал активность НАДН-оксидазы примерно на 9,35%, в то время как эфирное масло Cymbopogon flexuosus, или ЭО, при концентрации 10 частей на миллион снижало окисление НАДН и снижение содержания кислорода примерно на 34%, что указывает на ингибирование транспорта электронов между комплексом I и комплексом IV. Кавакрол снижал активность сукцинатоксидазы примерно на 10,84% у личинок Aedes aegypti, и Cymbopogon flexuosus EO снижал активность сукцинатоксидазы до 50% в изолированных митохондриях печени крыс, что указывает на ингибирование между комплексом II и комплексом IV. Cavacrol снижал активность цитохром с редуктазы NADH и окисление цитохром с и снижение кислорода в комплексе IV у личинок Aedes aegypti, в то время как Cymbopogon flexuosus EO снижал активность цитохром с оксидазы примерно на 58% в митохондриях печени крыс.
