Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся механизмов и энергии транспортировки белка через хлоропластовые мембраны, а также расположение белков в пластидах. Основным преимуществом этого метода для таргетинга тилакоида белка является то, что он позволяет осуществлять полный контроль над окружающей средой тилакоида во время транспортировки, включая температуру, рН, ионные условия и концентрации прекурсоров. Начните с замачивания примерно 55 граммов гороха в 400 миллилитров дистиллированной воды в течение трех часов.
Посеять пропитанный горох в пластиковый лоток в почве, покрытый тонким слоем вермикулита, и расти в течение девяти-15 дней, как описано в текстовом протоколе. В день изоляции хлоропласта подготовьтесь к градиенту непрерывной плотности, центрифугировать смесь из 15 миллилитров Percoll и 15 миллилитров буфера 2xGB в 15 миллилитровом поликарбонатной высокой скорости центрифугной трубки на 30 900 г в роторе с фиксированным углом в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия с выключенным тормозом. Затем урожай примерно 25 граммов от девяти до 15 дней побеги гороха.
Добавьте их в 95 миллилитров холодного буфера 1xGB в охлажденном блендере, с заточенными лезвиями. И гомогенизировать. Фильтр этой смеси через минимум два слоя сыра ткань, помещенная в воронку над охлажденным стаканом.
Центрифуга фильтрата с использованием 15 миллилитров поликарбонатной центрифуги трубки в размахивая ротор ведро на 3000 г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и используйте кисть, чтобы аккуратно повторно использовать гранулы в один миллилитр 1xGB. После этого используйте стеклянную позу пипетки, чтобы тщательно слой подвески экрана на верхней части градиента Percoll.
Центрифуга его в размахивая ротором ведро на 8000 г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию с торможением. Используя позу пипетки снова тщательно передать нижнюю зеленую полосу, содержащую нетронутые хлоропласты в свежие 50 миллилитров поликарбонатной трубки и добавить 30 миллилитров буфера 1xIB. Центрифуга трубки в размахивая ротор ведро на 1800 г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
После отказа от супернатанта, аккуратно повторно помесить гранулы в один миллилитр 1xIB с кистью. Вымойте в 30 миллилитров 1xIB и центрифуги снова при тех же условиях. Повторное производство гранул после окончательной центрифугации в один миллилитр 1xIB.
Для определения концентрации хлорофилла смешайте 10 микролитров полностью рсюпенных хлоропластов с пятью миллилитров 80%ацетона. Фильтр через фильтровальную бумагу толщиной 180 микрометров с размером 11 микрометров, а затем определить концентрацию хлорофилла по спектрофотометру. Разбавить смесь хлоропласта до одного миллиграмма на миллилитр с помощью холодного 1xIB.
Чтобы начать изолировать тилакоидов, когда стромальный экстракт не является необходимым, таких как cpTat транспорта, центрифуги нетронутыми хлоропластов в 1,5 миллилитров труб в размахивая ротор ведро на 1000 г при четырех градусах Цельсия в течение шести минут. После этого, отбросить супернатант и повторно гранулы в гипотонический буфер лиза для достижения одного миллиграмма на миллилитр с micropipette. Инкубировать на льду в темноте с редким смешивания в течение 10 минут.
Чтобы восстановить тилокоиды, центрифуга в размахивая ротором ведро на 3200 г при четырех градусах по Цельсию в течение восьми минут. Вымойте тилокоиды дважды, повторно поместив гранулы с одного до двух миллилитров буфера лиза, а затем центрифугирования в тех же условиях. После окончательной центрифугации, resuspend гранулы, в один миллилитр 1xIB буфера и определить концентрацию хлорофилла в изолированных тилокоидов с помощью спектрофотометра, как это было ранее продемонстрировано.
Для путей, которые требуют стромального восстановления экстракта, таких как CPSec1 и CPSRP eliquate 600 микролитров изолированных хлоропластов в размахивая ротора ведро и центрифуги на 1000 г в течение шести минут при четырех градусах по Цельсию. При хлоропластовом лизе мы приостанавливаем гранулы 600 микролитров гипотонического лиза буфера. Инкубировать на льду в темноте в течение 10 минут с случайным смешивания.
Затем центрифуга труб в размахивая ротор ведро на 3200 г в течение восьми минут при четырех градусах по Цельсию. Чтобы сохранить строму, перенесите светло-зеленый в желтый супернатант в новую микро-центрифугу трубки и добавить равный объем 2x сырой стромальный буфер. Чтобы вымыть тилокоиды, добавьте два тома буфера лиза и центрифугу при 3200 г в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия.
Повторное использование гранул в 1xIB для достижения концентрации хлорофилла в один миллиграмм на миллилитр и отложить на лед для более длительного использования в транспортных анализах. Удалите остаточные мембраны из сырой стромы путем центрифугирования разбавленной сырой стромы в роторе с фиксированным углом при 42 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем соберите 95% объема с каждой трубки убедившись, что не беспокоить небольшой желто-зеленый гранулы, при этом, унося объем, взятый из каждой трубки.
Чтобы подготовить концентрированный стромальный экстракт, объединить собранные супернатанты. Затем используйте четырехми миллилитр 30 килодальтон молекулярный концентратор для разрезателя веса, чтобы сконцентрировать экстракт в пять раз. Для анализа транспорта cpTat в 1,5 миллилитровой трубке на льду смешивают изолированные тилокоиды до конечной концентрации хлорофилла 0,33 миллиграмма на миллилитр, пять миллимолярной АТФ, подготовленной в 1xIB, и восемь миллимолярной DTT, подготовленной в 1xIB.
Чтобы инициировать транспортировку, ввемите в транспортную смесь субстратовый белок. Проводите реакцию, освещая подвеску 80-100 микроиенштейнами на квадратный метр в секунду фотосинтетически активного излучения в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы остановить транспортную реакцию, разбавить подвеску восемь раз ледяным 1xIB.
Центрифуга при 3200 г микро центрифуги в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для восстановления тилокоидов. После отказа от супернатанта, повторное производство гранул в 120 микролитров ледяной 1xIB. Для анализа ПУТЕЙ CPSec1 или PSRP смешивают следующее в 1,5 миллилитровой трубке на льду.
Тилакоиды к окончательной концентрации хлорофилла 0,33 миллиграмма на миллилитр, 0,83 миллиграмма на миллилитр хлорофилла эквиваленты стромального экстракта, и пять миллимолярный АТФ, подготовленный в 1xIB. Довнесите реакцию до нужного объема с ледяным холодом 1xIB и инкубировать на льду в течение 10 минут. Для инициирования транспортировки вводят 10%-ный объем по объему субстратного белка в эту транспортную смесь.
Осветите с 80 до 100 microeinsteins в квадратный метр в секунду фотосинтетически активного излучения в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы остановить реакцию, разбавьте подвеску восемь раз ледяным 1xIB. Центрифуга при 3 200г в микро центрифуге в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После отказа от супернатанта, повторное производство гранул в 120 микролитров ледяной 1xIB. Чтобы удалить остаточный субстрат, который не был транспортирован, усваивает внешний белок, добавляя шесть микролитров по два миллиграмма на миллилитр термолизина и 10 миллимолярный хлорид кальция в 1xIB. Инкубировать эту реакцию protease на льду в течение 40 минут.
Утолить протеазу, удвоив объем с 25 миллимолейной EDTA в 1xIB. Центрифуга при 3200 г микро центрифуги в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для восстановления тилокоидов. После удаления супернатанта, resuspend восстановить тилокоиды в 120 микролитров из пяти milimolar EDTA в 1xIB, и перейти на новый 1,5 миллилитров трубки.
После центрифугирования снова на 3, 200 г в микро центрифуге в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, отбросить супернатант и повторно гранулы в соответствующем объеме буфера образца laemmli, дополненный 10 миллимолярнов EDTA. Поместите образцы в кипящую ванну в течение 10 минут. Продолжить анализ образцов на странице SDS.
Транспортировка белка iOE17 по пути cpTat привела к сдвигу размеров от двух до трех килодалтов между введенным субстратом и зрелой обработанной формой. Это связано с расщеплением пептида n терминального сигнала, указывающего на успешный транспорт cpTat. Термолизин лечение оставляет только успешно транспортируется и, следовательно, протеус устойчивы зрелой полосы.
Транспортировка прекурсора OE33 по пути CPSec1 привела к сдвигу размеров зрелого субстрата и защите протеуса транспортного субстрата. Вставка прекурсора LHCP в мембрану тилокоида через путь CPSRP, оцененный через переваривание термолизина, привела к сдвигу размера от 1,5 до двух килодальтонов. Это указывает на успешную мембранную вставку, так как мембрана защищает неохватитный зрелый продукт деградации LHCP от полного протеолиза.
После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как изолировать тилокоиды и анализа транзистории через энергозависимых cpTat, cpSec 1 и CPSRP путей. После освоения этот метод может быть сделано в течение трех-четырех часов при правильном исполнении. Хотя не иллюстрируется в этом видео мы обычно держать накладные огни выключены в лаборатории при изоляции и работы с фотосинтетически активных хлоропластов и тилакоидов.
При попытке этой процедуры важно сохранить изолированные хлоропласты и тилакоиды при четырех градусах Цельсия. Не забудьте повторно хлоропласты мягко в начале. Избегайте нарушений градиента Procoll после первого шага центрифугации.
Кроме того, процент входной выборки может быть подготовлен параллельно с транспортными реакциями и работать на том же геле для оценки транспорта субстрата. Не забывайте, что работа с радиоактивными субстратами требует добросовестного обращения и надлежащего СИЗ. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области белка ориентации для изучения энергии, кинетики и уникальных механизмов, регулирующих транспортировку белка через тилакоид мембран.
