В этом протоколе мы предлагаем пошаговую инструкцию по измерению связанного с тромбоцитами тканевого фактора с помощью проточной цитометрии цельной крови, оценки белка во внутриклеточном компартменте, в условиях остановки и на поверхности клетки, как в состоянии покоя, так и при активации При ДП один из наиболее распространенных тканевых агонистов тромбоцитов экспрессируется подмножеством тромбоцитов. Если в плазме, обогащенной тромбоцитами PRP, или в отмытых тромбоцитах измеряют тромбоциты, положительные на тканевой фактор, эта подпопуляция может быть потеряна во время подготовки образца. Этот риск не возникает, когда эта оценка выполняется в стене.
Фактор, связанный с тканями крови, вызывал споры с момента первого отчета, опубликованного в начале века, из-за преданалитических и методологических проблем. Этот протокол проливает свет на эти вопросы, а также используется для проведения международного проекта, поддерживаемого Международным обществом тромбоза и гемостаза ISDH для стандартизации измерения тромбоцитарного фактора, связанного с тканями, или цитометрия кровотока выполняется на нескольких микролитрах крови, что позволяет проводить анализ тромбоцитарного фактора, связанного с тканями, подходящий в клинических условиях. Кроме того, возможность фиксации образца и последующей маркировки делает этот анализ возможным для многих больниц и лабораторий.
Для начала подготовьте по одной пробирке для каждого объема антител. Для проверки добавьте одну каплю отрицательных шариков и одну каплю положительных шариков в каждую пробирку. Добавьте по 20 микролитров каждого разведения антител в пробирку и сделайте вихрь.
Сразу же инкубируйте пробирки в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем добавьте по одному миллилитру PBS без кальция и магния pH 7,4 на каждую пробирку и вихрь, аккуратно переверните цитрат натрия вакутайнер пять раз, чтобы кровь и антикоагулянт тщательно перемешались. Перенесите 50 микролитров крови в пробирку объемом 1,5 миллилитров.
Затем добавьте 950 микролитров 1%-ного параформного альдегида. Аккуратно перемешайте и выдержите образец в течение 90 минут при комнатной температуре. Теперь центрифугируйте образец при 1,500 G в течение пяти минут с перерывом при комнатной температуре.
После удаления надосадочной жидкости Риз суспензируйте гранулу в одном миллилитре PBS без кальция и магния. При pH 7,4 дозируйте 100 микролитров фиксированной крови в каждую пробирку и центрифугируйте их при 1500 G в течение пяти минут. С перерывом при комнатной температуре, затем удалить надосадочную жидкость.
Суспензируйте гранулу в 100 микролитрах 0,1% Triton PBS для проникновения образцов и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Для начала подготовьте одну пробирку для флуоресценции минус одну контрольную и одну пробирку для окрашивания тканевым фактором. Добавьте антитела к 100 микролитрам неподвижной и перме цельной крови в каждую пробирку.
Добавьте 300 микролитров PBS без кальция и магния при pH 7,4 в каждую пробирку и перемешайте. Затем храните окрашенные образцы в темноте до тех пор, пока анализ проточной цитометрии не разбавит альфа CD 1 42 HTF одним моноклональным антителом и Alexa Fluer 6 33 коз антимышиным иммуноглобулином G в PBS без кальция и магния. Затем подготовьте три пробирки для образцов и дозируйте PBS без кальция и магния.
При pH 7,4 дозируйте 7,5 микролитров разведенного альфа-CD 1 42 htf одного моноклонального антитела и добавьте пять микролитров аденозиндифосфата. Осторожно переверните цитратный вакутайнер пять раз, чтобы тщательно перемешать кровь и антикоагулянт. Налейте по пять микролитров цельной крови в каждую пробирку.
Аккуратно перемешайте образцы и выдержите 20 минут при комнатной температуре. Для фиксации образца добавьте в каждую пробирку по 300 микролитров 1%-ной PFA и центрифугируйте при 1,500 G в течение пяти минут с перерывом при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости ревностную жидкость суспендирует гранулу в 90 микролитрах PBS без кальция и магния.
При pH 7,4 путем аккуратного пипетирования дозируйте пять микролитров разбавленного иммуноглобулина Alexa Fluer 6 33 G и пять микролитров альфа CD 41 PE в каждую пробирку. Инкубируйте образцы в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. Затем добавьте в каждую пробирку по 300 микролитров PBS без кальция и магния при pH 7,4 и перемешайте.
Для начала создайте прямую точечную диаграмму области рассеяния и боковую точечную диаграмму на логарифмической шкале, отображающую все события, создайте точечную диаграмму CD 61 A и боковую точечную диаграмму на логарифмической шкале, отображающую все события. Чтобы визуализировать популяцию тромбоцитов, установите пороговое значение приблизительно 2000 на высоте бокового рассеяния и 1000 на CP B six 90 H. Отрегулируйте PE Y 5 8 5 и для CP B six 90 в соответствии с ежедневным контролем качества и установите низкий расход. Теперь нарисуйте область между 10 лучами в степени трех и 10 лучами в степени пяти, называемую CD 61 положительной.
Чтобы идентифицировать популяцию тромбоцитов, затем дублируйте FMO и переименуйте его в TFIC. Соберите образцы и запишите файл данных с 10 000 событий в положительном вентиле CD 61. Создайте прямую область рассеяния и боковую точечную диаграмму на логарифмической шкале, отображающую все события.
Создайте CD 41 A и боковую точечную диаграмму на логарифмической шкале, отображающую все события. Затем отрегулируйте усиление Alexa floor 6 33 и усиление PE Wifi 5 8 5 в соответствии с ежедневным контролем качества. Установите пороговое значение приблизительно 1000 на высоте бокового рассеяния и на 2,500 на PEY 5 85 H.To визуализируйте популяцию тромбоцитов, установите низкую скорость потока.
Теперь нарисуйте область между 10 лучами в степени четырех и 10, поднятыми в степень пяти, называемыми CD 41 положительными, чтобы определить популяцию тромбоцитов. Затем создайте пробирку для каждого образца и назовите TF Unstimulated и TF Stimulated. Соберите образцы и запишите файл данных с 10 000 событий в центрифуге с положительной походкой CD 41.
0,129 молярного цитрата натрия вакутанер при 100 G в течение 10 минут без перерыва при комнатной температуре. Затем снимите вакуумер с центрифуги. Соберите полученную обогащенную тромбоцитами плазму, перенесите ее в полипропиленовую пробирку объемом 10 миллилитров и запишите объем собранного количества тромбоцитов дважды в обогащенную тромбоцитами плазму с помощью счетчика клеток крови.
Популяция тромбоцитов, идентифицированная с помощью окрашивания антител альфа CD 61, показала, что примерно 26,8% циркулирующих тромбоцитов содержали внутриклеточный тканевый фактор, анализ проточной цитометрии показал, что тканевый фактор экспрессируется примерно 2,8% тромбоцитов в состоянии покоя и увеличивается до 24,5% после активации аденозиндифосфатом. Было показано, что тромбоциты большего размера экспрессируют более высокие уровни тканевого фактора, а зеленые точки представляют большую субпопуляцию тромбоцитов. Анализ проточной цитометрии показал, что обогащенная тромбоцитами плазма, полученная с использованием центрифугирования 100 g, сохраняет популяцию, аналогичную цельной крови, сохраняя тромбоциты большего размера с более высокой положительностью тканевого фактора.
Более высокая сила центрифугирования приводила к потере большего количества тромбоцитов с положительным тканевым фактором, о чем свидетельствует уменьшение прямого разброса в популяции PRP.
