이 프로토콜에서는 전혈 유세포 분석으로 혈소판 관련 조직 인자를 측정하고, 세포 내 구획의 단백질을 평가하고, 정지 상태 및 활성화 시 세포 표면에서 단백질을 평가하기 위한 단계별 자습서를 제안합니다. DP를 사용하면 가장 일반적인 혈소판 작용제 조직 인자 중 하나가 혈소판의 하위 집합으로 발현됩니다. PRP 혈소판이 풍부한 혈장 또는 세척된 혈소판에서 조직 인자 양성 혈소판을 측정하는 경우 이 하위 집합은 검체 준비 중에 손실될 수 있습니다. 이 평가가 벽에서 수행될 때는 이 위험이 발생하지 않습니다.
혈액 플레이트 관련 조직 인자는 사전 분석 및 방법론적 문제로 인해 세기 초에 발표된 첫 번째 보고서 이후 논란이 되어 왔습니다. 이 프로토콜은 이러한 문제를 조명하고 국제 혈전증 및 지혈 학회(International Society of Thrombosis and hemostasis ISDH)가 지원하는 국제 프로젝트를 수행하는 데 사용되어 혈소판 관련 조직 인자 측정을 표준화하거나 몇 마이크로리터의 혈액에서 혈류 세포 분석을 수행하여 임상 환경에 적합한 혈소판 관련 조직 인자 분석을 가능하게 합니다. 또한 샘플을 고정하고 나중에 라벨링할 수 있는 가능성으로 인해 많은 병원 및 실험실에서 이 분석을 실현할 수 있습니다.
시작하려면 각 항체 부피에 대해 하나의 시험관을 준비합니다. 테스트하려면 각 테스트 튜브에 음성 비드 1방울과 양성 비드 1방울을 추가합니다. 각 항체 희석액 20마이크로리터를 시험관과 와류에 첨가합니다.
즉시 시험관을 실온의 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 칼슘과 마그네슘 pH 7.4가 없는 PBS 1밀리리터를 각 튜브와 와류에 추가하고 구연산나트륨 진공 청소기를 5번 부드럽게 뒤집어 혈액과 항응고제를 완전히 혼합합니다. 50마이크로리터의 혈액을 1.5ml 튜브에 넣습니다.
그런 다음 950 마이크로 리터의 1 % 파라 폼 알데히드를 첨가하십시오. 샘플을 부드럽게 혼합하고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 지금 1, 실내 온도에 틈을 가진 5 분 동안 500 G에 표본을 분리기로 하십시오.
상등액 Reese를 제거한 후 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 1ml에 펠릿을 현탁시킵니다. pH 7.4에서 각 튜브에 100마이크로리터의 고정 혈액을 분배하고 1, 500G에서 5분 동안 원심분리합니다. 실온에서 휴식을 취한 다음 상층액 소련을 제거하십시오.
펠릿을 100마이크로리터의 0.1%Triton PBS에 현탁시켜 샘플을 침투시키고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 먼저 형광에서 대조군 하나를 뺀 튜브 1개와 조직 인자 염색을 위한 튜브 하나를 준비합니다. 각 튜브에 있는 100마이크로리터의 고정 및 투과 전혈에 항체를 추가합니다.
pH 7.4의 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 300마이크로리터를 각 튜브에 넣고 섞습니다. 그런 다음 유세포 분석 분석이 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS에서 알파 CD 1 42 HTF 단일 클론 항체 1개와 Alexa Fluer 6 33 염소 항 마우스 면역글로불린 G를 희석할 때까지 염색된 샘플을 어두운 곳에 보관합니다. 다음으로, 3개의 샘플 튜브를 준비하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS를 분주합니다.
pH 7.4에서 7.5 μl의 희석 된 alpha CD 1 42 htf 1 개의 단일 클론 항체를 분배하고 5 μl의 adenosine diphosphate를 첨가합니다. 구연산염 액포를 5회 부드럽게 뒤집어 혈액과 항응고제를 완전히 혼합합니다. 각 튜브에 5마이크로리터의 전혈을 분배합니다.
샘플을 부드럽게 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 샘플 정착을 위해 각 튜브에 300 마이크로 리터의 1 % PFA를 추가하고 실온에서 5 분 동안 1, 500 G에서 원심 분리하십시오. 상등액이 제거되면 resus는 칼슘과 마그네슘이 없는 90마이크로리터의 PBS에 펠릿을 현탁시킵니다.
pH 7.4에서 부드럽게 피펫팅하여 희석된 Alexa Fluer 6 33 면역글로불린 G 5마이크로리터와 알파 CD 41 PE 5마이크로리터를 각 튜브에 분주합니다. 실온의 어두운 곳에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 pH 7.4의 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 300마이크로리터를 각 튜브에 넣고 섞습니다.
시작하려면 모든 이벤트를 표시하는 로그 스케일에 전방 산란 영역 및 측면 산란 영역 점도를 만들고, 모든 이벤트를 표시하는 로그 스케일에 CD 61 A 및 측면 산란 영역 점도를 만듭니다. 혈소판 개체군을 시각화하려면 측면 산란 높이에서 임계값을 약 2000으로 설정하고 CP B six six 90 H에서 임계값을 1000으로 설정합니다.일일 품질 관리에 따라 PE Y 5 8 5 및 CP B six six 90 gain을 조정하고 유속을 낮게 설정합니다. 이제 10 광선을 3의 거듭 제곱과 10 광선을 5의 거듭 제곱으로 CD 61 포지티브라고하는 영역을 그립니다.
혈소판 집단을 식별하려면 FMO를 복제하고 이름을 TFIC로 바꿉니다. 샘플을 획득하고 CD 61 포지티브 게이트 내에서 10, 000 이벤트의 데이터 파일을 기록합니다. 전방 산점도 영역과 측면 산점도 영역 점도표를 로그 스케일에 만들어 모든 이벤트를 표시합니다.
CD 41 A 및 측면 산란 영역 점도를 모든 이벤트를 표시하는 로그 스케일로 만듭니다. 그런 다음 일일 품질 관리에 따라 Alexa floor 6 33 게인과 PE wifi 5 8 5 게인을 조정합니다. 측면 산란 높이에서 임계값을 약 1000으로 설정하고 PEY 5 85에서 2, 500으로 설정하여 혈소판 집단을 시각화 H.To 유속을 낮음으로 설정합니다.
이제 10선에서 4의 거듭제곱 사이의 영역을 그리고 10을 5의 거듭제곱으로 높여 CD 41 양성이라고 하는 영역을 그려 혈소판 집단을 식별합니다. 그런 다음 각 샘플에 대한 튜브를 만들고 TF Unstimulated 및 TF Stimulated라는 이름을 지정합니다. 표본을 취득하고 10의 데이터 파일, CD 41 긍정적인 보행 분리기 내의 000의 사건을 기록하십시오.
0.129 몰 구연산 나트륨 진공 청소기는 실온에서 10 분 동안 휴식없이 100G에서 사용할 수 있습니다. 그런 다음 원심분리기에서 진공 청소기를 제거합니다. 얻어진 혈소판 풍부 혈장을 채취하여 10ml 폴리프로필렌 튜브에 옮기고 수집된 혈소판 계수 혈소판을 혈구 계수기를 사용하여 혈소판 풍부 혈장에 2회 기록한다.
알파 CD 61 항체 염색으로 확인된 혈소판 집단은 약 26.8%의 순환 혈소판이 세포 내 조직 인자를 함유하고 있음을 보여주었으며, 유세포 분석 결과 조직 인자는 약 2.8%의 휴지 혈소판에 의해 발현되며 아데노신 이인산으로 활성화되면 24.5%로 증가함을 나타냈습니다. 크기가 큰 혈소판은 더 높은 조직 인자 수준을 발현하는 것으로 나타났으며, 녹색 점은 더 큰 혈소판 부분 집합을 나타냅니다. 유세포 분석 분석은 100g의 원심분리를 사용하여 준비된 혈소판이 풍부한 혈장이 전혈과 유사한 집단을 보존하여 더 높은 조직 인자 양성률을 가진 더 큰 크기의 혈소판을 유지하는 것을 보여주었습니다.
더 높은 원심분리력은 PRP 집단에서 감소된 전방 산란에서 알 수 있듯이 더 큰 조직 인자 양성 혈소판의 손실로 이어졌습니다.
