Мы разработали чувствительный и количественный анализ на основе клеточных культур, который может быть использован для оценки передачи сигналов Sonic Hedgehog, которая передается в основном через первичные реснички. Этот анализ может быть использован для изучения генетических и эпигенетических изменений, которые связаны с первичной дисфункцией ресничек. Несмотря на центральную роль первичных ресничек в передаче сигналов Sonic Hedgehog, современным методологиям часто не хватает чувствительности, необходимой для оценки функции первичных ресничек при генетических изменениях.
Этот протокол заполняет этот пробел, обеспечивая анализ на основе клеточных культур, имитирующий активацию Sonic Hedgehog и экспрессию генов-мишеней Sonic Hedgehog в реснитчатых клетках. По сравнению с другими протоколами, такими как локализация разглаженного белка вдоль первичных ресничек при активации пути Sonic Hedgehog, наш анализ является количественным, простым для понимания и чувствительным, поскольку он основан на клеточной культуре. Для начала извлеките колбу для клеточных культур T25, содержащую почти сливающиеся клетки RPE-1, растущие в пяти миллилитрах полной среды, из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.
Выбросьте питательную среду из колбы для клеточных культур и вытесните клетки с ферментативной активностью предварительно подогретого 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Повторно суспендируйте клетки в колбе, используя предварительно подогретую готовую среду. Подсчитайте клетки на гемоцитометре, чтобы определить клеточную плотность суспензии.
Поместите две стерильные 12-миллиметровые крышки в две 35-миллиметровые чашки для клеточных культур. Посейте семена два раза по 10 в степени пяти асинхронно растущих клеток RPE-1 в каждой чашке, содержащей покровные листки. Добавьте по два миллилитра готовой среды в каждое блюдо и выращивайте клетки в течение 24 часов.
После инкубации удалите среду из растущих клеток СИЗ-1 и промойте клетки один раз одним миллилитром предварительно подогретого буфера DPBS. Добавьте в каждое блюдо два миллилитра предварительно подогретой среды DMEM, содержащей 1% пенициллина стрептомицина без FBS. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.
На следующий день замените среду средой, испытывающей нехватку сыворотки, содержащей разглаженный агонист в конечной концентрации 250 наномоляров. Инкубируйте клетки еще 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После инкубации переложите покровные стекла в 24-луночный планшет, поместив по одному покровному листу в каждую лунку.
Добавьте в каждую лунку по 0,5 миллилитра охлажденного метанола для фиксации клеток. Выдерживайте тарелку при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 10 минут. Сразу же трижды постирайте чехол с 0,5 миллилитров буфера для стирки.
Выбросьте среду из посуды. Добавьте 0,5 миллилитра реагента ТРИзол непосредственно в каждую посуду. Равномерно распределите реагент и дайте ему постоять пять минут.
Сделайте пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы создать однородную смесь, и соберите ее в 1,5 миллилитра, не содержащие нуклеазы микроцентрифуги Добавьте 0,1 миллилитров хлороформа в каждую пробирку, содержащую тризол-смешанные клетки, обработанные разглаженным агонистом и ДМСО. Инкубируйте пробирки в течение двух-трех минут перед центрифугированием при 12 000 г при четырех градусах Цельсия. Перенесите водную фазу, содержащую РНК, в свежие микроцентрифужные пробирки.
Добавьте в водную фазу 0,25 миллилитра изопропанола и инкубируйте пробирки в течение 10 минут. Центрифугируйте образцы при 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Наблюдайте за образованием белой гелеобразной РНК-гранулы.
Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки. Затем ресуспендируйте гранулу РНК в 0,5 миллилитрах свежеразведенного 75% этанола. Кратковременно перебейте трубки, чтобы обеспечить перемешивание.
Центрифугируйте образцы при температуре 7 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки. Высушите гранулы РНК на воздухе в течение 10 минут.
Ресуспендируйте гранулы в 25 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Измерьте общую концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра с точностью до 260 нанометров. Используйте от одного до трех микрограммов общей РНК из каждого образца для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя для набора для синтеза кДНК.
Настройте реакции количественной ПЦР в трех экземплярах с использованием разбавленной кДНК в соотношении от одного до пяти из каждого образца с наборами праймеров генов GLI1, PTCH1, HHIP, SMO и бета-актина, с мастер-смесью для количественной ПЦР в многолуночном флуоресцентно-чувствительном ПЦР-планшете. Накройте ПЦР-планшет подходящим герметиком. Поместите планшет в прибор для количественной ПЦР.
Запустите стандартизированную программу количественной ПЦР с 40 циклами амплификации с последующим анализом кривой плавления. После прогона проверьте кривую расплава каждого ампликона на наличие одного пика при желаемой температуре. Экспортируйте данные об усилении в таблицу.
Рассчитайте относительную экспрессию каждого транскрипта путем нормализации по отношению к экспрессии бета-актина, нанесите данные относительной экспрессии на график и рассчитайте статистическую значимость изменений в экспрессии с помощью непарного t-критерия. Большинство клеток, испытывающих недостаток в сыворотке, собрали первичные реснички с более чем 85% ресничек. В этом состоянии уровни экспрессии GLI1, PTCH1 и HHIP были значительно повышены в гладких клетках, обработанных агонистами, по сравнению с клетками, обработанными ДМСО, в то время как уровни транскрипта SMO не показали существенных изменений.
