Desenvolvemos um ensaio sensível e quantitativo baseado em cultura de células que pode ser usado para avaliar a sinalização Sonic Hedgehog, que é transduzida principalmente através dos cílios primários. Este ensaio pode ser usado para examinar alterações genéticas e epigenéticas, que estão associadas à disfunção primária dos cílios. Apesar do papel central dos cílios primários na sinalização do Sonic Hedgehog, as metodologias atuais muitas vezes carecem da sensibilidade necessária para avaliar a função dos cílios primários sob alterações genéticas.
Este protocolo preenche essa lacuna fornecendo um ensaio baseado em cultura de células, imitando a ativação do Sonic Hedgehog e a expressão do gene alvo do Sonic Hedgehog em células ciliadas. Em comparação com outros protocolos, como a localização de proteína suavizada ao longo dos cílios primários após a ativação da via Sonic Hedgehog, nosso ensaio é quantitativo, fácil de seguir e sensível, pois é baseado em cultura de células. Para começar, remova o frasco de cultura de células T25 contendo células RPE-1 quase confluentes crescendo em cinco mililitros de meio completo de uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Descarte o meio de cultura do frasco de cultura de células e desaloje as células com a atividade enzimática de uma solução pré-aquecida de tripsina-EDTA a 0,25%. Ressuspenda as células em um frasco usando um meio completo pré-aquecido. Conte as células em um hemocitômetro para determinar a densidade celular da suspensão.
Coloque duas lamínulas estéreis de 12 milímetros em duas placas de cultura de células de 35 milímetros. Semeie duas vezes 10 elevado a cinco células RPE-1 de crescimento assíncrono em cada prato contendo lamínulas. Adicione dois mililitros de meio completo a cada prato e cultive as células por 24 horas.
Após a incubação, remova o meio das células RPE-1 em crescimento e lave as células uma vez com um mililitro de tampão DPBS pré-aquecido. Adicione dois mililitros de meio DMEM pré-aquecido contendo 1% de penicilina estreptomicina sem FBS a cada prato. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
No dia seguinte, substitua o meio por um meio sem soro contendo um agonista suavizado a uma concentração final de 250 nanomolares. Incube as células por mais 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, transfira as lamínulas para uma placa de 24 poços, colocando uma lamínula em cada poço.
Adicione 0,5 mililitros de metanol resfriado a cada poço para fixar as células. Incube a placa a menos 20 graus Celsius por 10 minutos. Lave imediatamente as lamínulas três vezes com 0,5 mililitros de tampão de lavagem.
Descarte o meio dos pratos. Adicione 0,5 mililitros de reagente TRIzol diretamente a cada prato. Distribua o reagente uniformemente e deixe repousar por cinco minutos.
Pipete para cima e para baixo algumas vezes para criar uma mistura homogênea e colete-a em tubos de microcentrífuga sem nuclease de 1,5 mililitro Adicione 0,1 mililitros de clorofórmio a cada tubo contendo células misturadas com TRIzol tratadas com um agonista suavizado e DMSO. Incube os tubos por dois a três minutos antes de centrifugar a 12.000g a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa que contém o ARN para tubos de microcentrífuga frescos.
Adicione 0,25 mililitros de isopropanol à fase aquosa e incube os tubos por 10 minutos. Centrifugue as amostras a 12.000g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Observe a formação de um pellet de RNA branco semelhante a um gel.
Descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta. Em seguida, ressuspenda o pellet de RNA em 0,5 mililitros de etanol a 75% recém-diluído. Agite brevemente os tubos para garantir a mistura.
Centrifugue as amostras a 7.500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta. Seque ao ar os pellets de RNA por 10 minutos.
Ressuspenda os pellets em 25 microlitros de água livre de nuclease. Meça a concentração total de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume a 260 nanômetros. Use de um a três microgramas de RNA total de cada amostra para sintetizar o cDNA seguindo as instruções do fabricante para um kit de síntese de cDNA.
Configure as reações de qPCR em triplicata usando cDNA diluído de um a cinco de cada amostra com conjuntos de primers de genes GLI1, PTCH1, HHIP, SMO e beta-actina, com uma mistura principal de qPCR em uma placa de PCR sensível à fluorescência de vários poços. Cubra a placa PCR com um selador adequado. Coloque a placa em um instrumento qPCR.
Execute o programa qPCR padronizado com 40 ciclos de amplificação, seguido por uma análise da curva de fusão. Após a execução, verifique a curva de fusão de cada amplicon para um único pico na temperatura desejada. Exporte os dados de amplificação para uma planilha.
Calcule a expressão relativa de cada transcrito normalizando a expressão de beta-actina, plote os dados de expressão relativa em um gráfico e calcule a significância estatística das mudanças na expressão usando um teste t não pareado. A maioria das células carentes de soro montou cílios primários com mais de 85% de ciliação. Nessa condição, os níveis de expressão de GLI1, PTCH1 e HHIP foram significativamente aumentados em células tratadas com agonistas lisos em comparação com células tratadas com DMSO, enquanto os níveis de transcritos de SMO não mostraram alterações significativas.
