Цель этого протокола — описать, как оценить количество и распределение отложений железа в мозге мышиной модели с болезнью Альцгеймера. В этом протоколе мы использовали восьмимесячных трансгенных мышей 5xFAD в качестве модели мышей AD и сравнили их с мышами дикого типа того же возраста. Мы подробно описываем процедуры приготовления химического реагента, разрезания мозга, окрашивания Perls/DAB и анализа полученных изображений.
Правильно обезболите мышь и проверьте глубину анестезии и обезболивания. Обнажите его сердце, затем разрежьте правое предсердие. Введите 20 миллилитров PBS и 4% PFA из левого желудочка последовательно.
Обратите внимание, что следует наблюдать фиксирующий тремор. Обезглавьте мышь и извлеките ее мозг. Затем зафиксируйте мозг в 4% PFA на 12-24 часа.
Погрузите мозг в 15% и 30% сахарозу на 12-24 часа. Разрежьте мозг сагибально от середины и используйте обе половины для разрезания. Установите мозг на ручку, оберните вокруг мозга кольцо из фольги и добавьте в него ОКТ, чтобы внедрить мозг.
Установите толщину секций и температуру криостата. Затем разрежьте мозг. Если пряди складываются, используйте мягкие щетки, чтобы развернуть пряди.
Соберите каждую секцию на горки с помощью PBS, затем устраните пузыри на секции. Выберите предметное стекло с неповрежденной тканью мозга и поместите его в пластиковую коробку для окрашивания, наполненную PBS. Установите коробку на вращающийся шейкер на медленную скорость на пять минут, чтобы тщательно смыть остатки OCT соединения.
Приготовьте 20 миллилитров 2%-ного ферроцианида калия и равный объем 2%-ной соляной кислоты. Затем смешайте их в центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров. Закрепите предметное стекло в трубке с помощью щипцов и выдержите смесь на предварительно разогретой водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Промойте предметное стекло PBS и сотрите лишнюю жидкость с помощью папиросной бумаги. Положите предметное стекло на лабораторный стол и даже нанесите раствор DAB на ткань с помощью пипетки. Выдерживайте в течение 10 минут, чтобы усилить окрашивание Perls.
Удалите излишки раствора DAB и прополощите салфетки, трижды промыв PBS. Последовательно обезвоживайте срез в растворах градуированного спирта и ксилола в течение трех минут каждый. Накройте секции нейтральной резинкой и покровным стеклом.
Затем дайте им высохнуть в вытяжном шкафу. Включите микроскоп. Отрегулируйте яркость источника света.
Сосредоточьтесь на участке мозга под объективом с 4-кратным увеличением. Переместите предметный столик микроскопа, чтобы сфокусироваться на областях с высоким уровнем окрашивания Perls/DAB, особенно на гиппокампе и коре головного мозга. и делать снимки.
Откройте изображение объектива с увеличением 10, а затем преобразуйте формат изображения в 8-битные оттенки серого. Значения серого изображения были преобразованы в значения OD, а затем использовалась функция порога для покрытия областей с положительным окрашиванием Perls/DAB. Выберите следующие параметры настройки и, что самое важное, выберите «Предел порога», чтобы исключить фоновый шум.
Наконец, выберите измерения, чтобы получить результаты для статистического анализа. Чтобы исследовать распределение и накопление железа в мышиной модели с болезнью Альцгеймера, мы выполнили окрашивание сагиттальных участков мозга методом Perls/DAB. Высокие сигналы Perls/DAB наблюдались в гиппокампе и коре головного мозга, особенно в субикулуме гиппокампа мышей 5xFAD, в то время как мозг двухмесячных и восьмимесячных мышей дикого типа показал более слабый сигнал.
При увеличении более 40 сигнал у мышей 5xFAD проявляется в структурах, похожих на A-бета-бляшки, что согласуется с предыдущими исследованиями. Эти результаты демонстрируют эффективность Perls/DAB в качестве гистохимического метода для обнаружения железа. Мы также покажем два случая неудачного окрашивания.
В этих случаях может произойти чрезмерное покрытие или неуместное обезвоживание. Окрашивание Perls/DAB обеспечивает более сильный сигнал и лучший контраст фона по сравнению с обычным окрашиванием Perls, что делает обнаружение железа более чувствительным и точным. Кроме того, он обнаруживает трехвалентное железо в слабо связанных белковых комплексах.
Железо, которое сильно связано, как в гемоглобине, не вступит в реакцию. Это значительно снижает нежелательные сигналы, вызванные железом в эритроцитах и гемоглобине. В целом, окрашивание Perls/DAB подходит для экспериментов на животных и патологических исследований, требующих медиальной специфичности и чувствительности.
Это дает исследователям возможность визуализировать и количественно оценить накопление железа за счет меньших затрат времени и средств.
