Этот метод экономии времени снижает изменчивость между раундами иммуноистохимических процедур в нейробиологии исследований для оптимизации визуализации анатомии и местных белков и тканей. Основным преимуществом этого метода является то, что он сокращает время, затязаемое на криозирование и крепление ткани мозга путем объединения нескольких мозгов в один замороженный блок. Хотя этот метод оптимизирован для корональных секций мозга грызунов, он может быть адаптирован к sagittal или поперечных секций или различных типов тканей, таких как мышцы или печень.
После успешной перфузии транскардиального, после фиксации мозга животных в 25 миллилитров флакон 4%paraformaldehyde в PBS в течение 24 часов. После этого используйте тупые наконечником типсы, чтобы удалить мозги из параформальдегида. Перенесите мозг на флакон с примерно 20 миллилитров 30% раствора сахарозы в TBS.
Держите мозги и раствор, пока они не опускаются на дно флакона. Затем поместите стеклянный стакан 500 миллилитров на кровать сухого льда в ведро со льдом. Затем залить от 300 до 400 миллилитров изопентанов в стакан.
Поддерживайте изопентан между отрицательными 45 и отрицательными 50 градусов по Цельсию. На верхней скамейке, заполнить одноразовые встраивания формы примерно на полпути полный с оптимальной температурой резки или OCT соединения. Используйте иглу, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из формы.
Используйте тупые наконечником типсы, чтобы удалить первый мозг из раствора сахарозы. Затем используйте новое лезвие бритвы, чтобы удалить мозжечок и обонятельные луковицы перед разделением полушарий. Далее, дайте мозгу числовую систему именования.
Используйте тупые типсы, забрать мозг, чтобы быть помещены в положение два, и сориентировать его со стороны, чтобы быть сокращены сначала лицом вверх. Опустите мозг в OCT и используйте пинцет, чтобы настроить свое положение, пока он не стоит самостоятельно. Ключевой модификацией этого метода является пустое пространство в позиции 1.
Это пространство предназначено для легкой идентификации мегабрейна ориентации и, следовательно, определить животное, связанное с каждым мозгом. После того, как все мозги были расположены в форме, добавить достаточно OCT для покрытия верхней части мозга, а затем использовать иглу, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Держите угол формы с типсами, чтобы типсы не были частично погружены в ОКТ.
Затем опустите плесень в изопентан так, чтобы нижняя треть формы была погружена в воду. Через 30 секунд опустите всю плесень в изопентан и отпустите ее из типсов. Через три минуты используйте типсы, чтобы удалить плесень из изопентан.
Немедленно оберните форму и ее содержимое в алюминиевую фольгу и этикетки его соответствующим образом. Перенесите мегабран в морозильную камеру с отрицательным 20 градусов по Цельсию в течение как минимум 24 часов. Во-первых, установите температуру криостата до минус 19 градусов по Цельсию.
Удалите мегабран из морозильной камеры и поместите его в криостат. Затем поместите патрон и две тонкие наконечником кисти в криостат. После этого наклеьте ярлык слайдов с идентификационный номер мегабрейна и номер слайда и положите слайды на слайд теплее.
Далее, развернуть мегабран и использовать лезвие бритвы, чтобы сократить углы формы. Выпределите тонкий слой OCT на патрон. Затем быстро поместите мегабран на патрон.
После того, как OCT полностью заморожен, нанесите двухмиллиметровый слой OCT по бокам мегабрейна и дайте ему бежать вниз по бокам на патрон. Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить излишки OCT со стороны и нижней части патрона. Во-первых, положение патрон установлен с мегабраном на чак голову криостата.
Затем установите криостат до нужной толщины. Обрезать OCT и ткани по мере необходимости для достижения желаемой области мозга для сбора тканей. Затем опустите анти-ролл пластины, пока он не лежит на сцене и включите ручку криостата принять одну секцию.
Медленно смахив противокатаную пластину, будьте осторожны, чтобы секция ткани не коснулась. Аккуратно используйте кисти, чтобы развернуть секцию ткани, пока она не лежит ровно. При необходимости удерживайте ОКТ квартиру с помощью кистей для предотвращения прокатки.
Затем удалите слайд с слайда теплее и наведите курсор на сторону слайда вниз по разделу мегабрейна и дайте ему прилипнуть к слайду. Быстро нанесите каплю PBS на секцию ткани. Используя тонкую наконечником кисть, смоченной в PBS, кисть из любых пузырьков в разделе ткани и разворачивать ткани, чтобы он лежал плашмя на слайде.
Наконец, поместите слайд на слайде теплее, чтобы высохнуть в течение 45 минут и хранить слайд при отрицательном 80 градусов по Цельсию. В этом протоколе, ткани мозга от девяти животных были подготовлены и криозекции одновременно. После криозирования, Н И Е окрашивание может быть проведено для оценки качества криопротекторной.
Репрезентативные результаты ионизированной молекулы адаптера связывания кальция один или Iba1 окрашивание микроглии показывают последовательное окрашивание между каждым исследованием мозга на одном мегабране. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы постоянно контролировать температуру при замораживании мегабрейна, чтобы предотвратить растрескивание или оттаивание, а затем заморозить ткани, что приводит к ненормальной целостности тканей. Не рекомендуется сегрегировать различные группы лечения в отдельные мегабраны, поскольку это может создать дисперсию между группами во время окрашивания и уменьшить предвзятость и субъективность во время визуализации и анализа.
Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как ношение PBE и работа в капюшоне, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
