В нашем исследовании оценивается груминговое поведение у Drosophila melanogaster после нокдауна Atg8a, опосредованного РНК-интерференцией, чтобы смоделировать дефицит GABARAP, наблюдаемый у пациентов с синдромом Туретта. Мы стремимся понять роль aAtg8a в поведенческом развитии, дав представление о регуляторных функциях его человеческого аналога в нейроповеденческих процессах. В настоящее время к числу экспериментальных проблем, связанных с методом ручного аннотирования, относятся сложный аналитический процесс, такой как аннотирование и просмотр отснятого материала, а также субъективность, связанная с ручным аннотированием.
Автоматизированные методы также сталкиваются с проблемами, в том числе с требованием значительных знаний в области информатики для эффективного внедрения и выполнения. Мы обнаружили, что ген Atg8a играет роль в развитии поведения у плодовых мушек, выходящую за рамки того, что было установлено ранее. В частности, мы обнаружили, что он регулирует как груминг, так и обучение, предполагая, что ортологи Atg8a могут играть аналогичную роль в других организмах.
Этот метод позволяет провести прямую количественную оценку частоты и распределения груминга у дрозофил. Это особенно полезно в лабораториях, где нет возможности использовать автоматизированные методы, и позволяет проводить более подробный анализ, чем косвенные методы, основанные на красителях. В целом, наше исследование способствует использованию дрозофилы в качестве модельного организма для изучения нарушений развития нервной системы, которые проявляют обсессивно-компульсивное поведение, такое как синдром Туретта.
Это также добавляет к растущему количеству доказательств того, что белки, связанные с аутофагией, играют роль в поведенческом развитии. Для начала поставьте четыре трехлуночные тарелки рядом друг с другом на белую поверхность и накройте каждую тарелку предметным стеклом. Расположите камеру над посудой.
Убедитесь, что на предметных стеклах нет бликов, которые могут ограничить видимость мух в блюде, и отрегулируйте положение тарелки или приглушите свет по мере необходимости, чтобы устранить блики. Теперь отметьте положение посуды и камеры на скамейке, где происходит запись. Поместите четырех-девятидневных мух на ледяную глыбу, покрытую парапленкой и бумажным полотенцем, чтобы слегка обезболить их.
После обезболивания как можно быстрее переместите мух в камеры наблюдения с помощью малярной кисти. Поместите по одной мухе в каждую лунку трехлуночной чашки, обеспечив минимальное беспокойство и не провоцируя изменения в поведении, вызванные стрессом. После акклиматизации мух через 30 минут после анестезии запишите мух с помощью камеры, затем откройте терминал и наберите cd PiSpy.
Введите python3 PiSpy. py и введите желаемую длину записи и частоту кадров. Выберите нужное разрешение и нажмите на кнопку «Быстрый захват».
Теперь используйте функцию предварительного просмотра камеры в Pi Spy, чтобы убедиться, что мухи находятся в фокусе и достаточно заметны. Записывайте мухи в течение 10 минут с рекомендуемой частотой кадров 24 кадра в секунду и сохраните файл. Чтобы проанализировать видео, импортируйте файл в программное обеспечение ELAN 6.8 для подробного аннотирования и глубокого анализа поведения груминга.
Выберите Уровень, Добавить новый уровень, введите местоположение в блюде в названии уровня и Добавить, чтобы назначить каждой строке, чтобы вручную аннотировать отснятый материал с отдельными людьми. Чтобы аннотировать поведение, дважды щелкните уровень, который нужно аннотировать, щелкните правой кнопкой мыши и перетащите курсор вдоль выбранного уровня в течение периода, в течение которого проводится один поединок по грумингу. Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы выбрать новую аннотацию, и дважды щелкните по вновь выделенному периоду времени, чтобы ввести аббревиатуру для поведения, наблюдаемого в этот момент времени.
После того, как видео будет полностью аннотировано, получите разбивку каждого поведения, нажав «Просмотр», а затем «Статистика аннотаций». Определите передний груминг как груминг, выполняемый в передней области тела мухи. Идентифицируйте задний груминг как груминг, выполняемый на передне-заднем конце тела мухи.
Количество приступов груминга значительно увеличилось у мутантов РНК-интерференции Atg8a по сравнению с контрольными группами. Время, затраченное на груминг, также было значительно увеличено у мутантов Atg8a RNAi по сравнению с контрольной группой. Не наблюдалось существенных различий в распределении переднего и заднего грумингового поведения.
