Araştırmamız, Tourette sendromlu hastalarda gözlenen GABARAP eksikliklerini modellemek için RNAi aracılı Atg8a yıkımından sonra Drosophila melanogaster'deki tımar davranışlarını değerlendirmektedir. aAtg8a'nın davranışsal gelişimdeki rolünü anlamayı, insan muadilinin nöro davranışsal süreçlerdeki düzenleyici işlevleri hakkında içgörüler sağlamayı amaçlıyoruz. Manuel açıklama yöntemiyle ilgili mevcut deneysel zorluklar, görüntülere açıklama ekleme ve gözden geçirme gibi karmaşık analitik süreci ve manuel açıklamada yer alan öznelliği içerir.
Otomatik yöntemler, etkili bir şekilde uygulamak ve yürütmek için önemli bilgisayar bilimi uzmanlığı gereksinimi de dahil olmak üzere zorluklarla da karşı karşıyadır. Atg8a geninin, meyve sineklerinde daha önce belirlenenin ötesinde davranış gelişiminde rol oynadığını bulduk. Daha spesifik olarak, hem tımar etmeyi hem de öğrenmeyi düzenlediğini bulduk, bu da Atg8a ortologlarının diğer organizmalarda benzer roller oynayabileceğini düşündürüyor.
Bu teknik, Drosophila'da tımar sıklığının ve dağılımının doğrudan ölçülmesine izin verir. Özellikle otomatik yöntemler kullanamayan laboratuvarlarda kullanışlıdır ve dolaylı, boya bazlı yöntemlerden daha ayrıntılı analizlere izin verir. Genel olarak, araştırmamız Drosophila'nın Tourette sendromu gibi obsesif-kompulsif davranış sergileyen nörogelişimsel bozuklukları incelemek için model bir organizma olarak kullanımını ilerletmektedir.
Ayrıca, otofaji ile ilgili proteinlerin davranışsal gelişimde rol oynadığına dair artan kanıtlara da katkıda bulunur. Başlamak için, dört adet üç kuyulu tabağı beyaz bir yüzeye yan yana yerleştirin ve her tabağı bir cam slaytla örtün. Bulaşıkların üzerine bir kamera yerleştirin.
Slaytlarda, tabaktaki sineklerin görünürlüğünü sınırlayabilecek parlama olmadığından emin olun ve parlamayı önlemek için plaka konumunu ayarlayın veya ışıkları gerektiği gibi kısın. Şimdi kaydın yapıldığı bankta bulaşıkların ve kameranın konumunu işaretleyin. Dört ila dokuz günlük sinekleri parafilm ile kaplı bir buz bloğu ve hafifçe uyuşturmak için bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
Anestezi uygulandıktan sonra, sinekleri bir boya fırçası kullanarak mümkün olduğunca çabuk gözlem odalarına taşıyın. Üç oyuklu tabağın her bir oyuğuna bir sinek yerleştirin ve strese bağlı davranış değişikliklerine neden olmamak için minimum rahatsızlık sağlayın. Anesteziden 30 dakika sonra sinekleri iklimlendirdikten sonra, bir kamera kullanarak sinekleri kaydedin, ardından terminali açın ve cd PiSpy yazın.
python3 PiSpy yazın. py ve istenen kayıt uzunluğunu ve kare hızını girin. İstediğiniz çözünürlüğü seçin ve Hızlı Yakalama'ya tıklayın.
Şimdi sineklerin odakta olduğundan ve yeterince görünür olduğundan emin olmak için Pi Spy'daki Önizleme Kamerası işlevini kullanın. Sinekleri saniyede 24 kare önerilen kare hızında 10 dakika boyunca kaydedin ve dosyayı kaydedin. Videoyu analiz etmek için, ayrıntılı açıklama ve tımar davranışlarının derinlemesine analizi için dosyayı ELAN 6.8 yazılımına aktarın.
Katman'ı seçin, Yeni Katman Ekle'yi seçin, katman adına çanağa konum yazın ve bireylerin görüntülerine manuel olarak açıklama eklemek için her satırı atamak için ekleyin. Davranışlara açıklama eklemek için, açıklama eklenecek katmana çift tıklayın, sağ tıklayın ve imleci, tek bir bakım nöbetinin sergilendiği bir süre boyunca seçili katman boyunca sürükleyin. Yeni ek açıklama seçmek için sol tıklayın ve o zaman noktasında gözlemlenen davranışın kısaltmasını yazmak için yeni vurgulanan zaman dilimine çift tıklayın.
Videoya tamamen açıklama eklendikten sonra, Görünüm'e ve ardından Ek Açıklama İstatistikleri'ne tıklayarak her davranışın bir dökümünü alın. Anterior tımarlamayı, sinek gövdesinin ön bölgesinde gerçekleştirilen tımar olarak tanımlayın. Posterior tımarlamayı, sinek gövdesinin ön-arka ucunda gerçekleştirilen tımar olarak tanımlayın.
Atg8a RNAi mutantlarında tımar nöbetleri kontrol gruplarına kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Tımar için harcanan zaman da Atg8a RNAi mutantlarında kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Anterior ve posterior tımar davranışlarının dağılımında anlamlı bir fark gözlenmedi.
