Наши исследования в первую очередь сосредоточены на связи между восстановлением ДНК и старением. В частности, мы рассматриваем различные расстройства ламинопатии и хотим узнать, как они могут повлиять на репарацию ДНК. Мы продемонстрировали, что расстройство ламинопатии, связанное с преждевременным старением и короткой продолжительностью жизни, известное как синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда, на самом деле связано с повышенным количеством повреждений ДНК и неточными репарациями ДНК.
Наша лаборатория хотела бы исследовать влияние потенциальных методов лечения пациентов с ламинопатией, чтобы узнать, окажут ли эти подходы положительное влияние на восстановление ДНК и повреждение ДНК. Для начала поместите по одной крышке в каждую лунку стерильной 6-луночной пластины с помощью щипцов. Добавьте два миллилитра модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium, или DMEM, в каждую лунку в 6-луночной пластине.
Аспирируйте среду из клеток HeLa, культивируемых в колбе, и промойте клетки, добавив 15 миллилитров PBS. Осторожно взболтайте колбу, чтобы промыть клетки, аспирируйте PBS и добавьте два миллилитра трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клетки. Поместите колбу, покрытую трипсином, в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом на две минуты, чтобы клетки могли отделиться.
Затем добавьте восемь миллилитров дополненного DMEM в колбу, содержащую трипсинизированные клетки, и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы разделить комкующиеся клетки. Соберите клеточную суспензию из колбы в 15-миллилитровую полистирольную трубку. После подсчета ячеек прибавьте по 500 000 ячеек по каплям непосредственно на каждую из покровных пластин в 6-луночном планшете.
Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом, чтобы клетки могли вырасти за ночь. Для фиксации клеток на следующий день следует аспирировать среду из лунок 6-луночного планшета. Добавьте по два миллилитра PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки и полностью аспирировать все PBS из лунок.
Затем добавьте по два миллилитра 4%-ного раствора формальдегида в каждую лунку на 10 минут при комнатной температуре и полностью отсасывайте раствор из лунок. Далее в каждую лунку добавьте по два миллилитра раствора для пермеабилизации. Дайте раствору постоять 10 минут при комнатной температуре, затем полностью аспирируйте его.
Промойте клетки трижды двумя миллилитрами PBS в каждой лунке. Полностью аспирируйте после каждого мытья. После того, как весь PBS будет аспирирован из лунок, добавьте два миллилитра буфера разбавителя антител, или ADB, в каждую лунку, чтобы блокировать клетки для иммунофлуоресцентного окрашивания.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут с легким встряхиванием орбиты. Ближе к концу периода блокировки. Готовят первичное разведение антител путем смешивания просвета B1 и двухцепочечных антител ДНК в ADB.
По окончании инкубации отсасывайте ADB из лунок. Прикрепите скотчем кусок парафиновой пленки к ровной поверхности, убедившись, что площадь достаточно велика для размещения всех обрабатываемых покровных стекол. Для каждого покровного промаха пипеткой нанесите 75 микролитров первичного разведения антител на парафиновую пленку, избегая образования пузырьков.
С помощью щипцов поместите каждую ячейку скользящей оболочки стороной вниз на каплю антитела. Накройте инкубационные крышки крышками крышки крышкой 6-луночной пластины и дайте крышке инкубироваться в течение одного часа при комнатной температуре. Затем с помощью щипцов осторожно снимите покровные листки с парафиновой пленки и поместите их обратно в 6-луночную пластину стороной ячейки вверх.
Постирайте чехлы, встряхнув их три раза в течение пяти минут с двумя миллилитрами PBST. Во время окончательной промывки приготовьте вторичное разведение антител. После последнего промывания полностью аспирируйте PBST.
Добавьте вторичное антитело к парапленке и поместите защитные листы на парафиновую пленку клеткой вниз. Затем наденьте на чехлы легкий защитный чехол, чтобы защитить клетки от света, и выдержите в течение 30 минут при комнатной температуре. С помощью щипцов осторожно снимите покровные стекла с парафиновой пленки и поместите их обратно в 6-луночный планшет, убедившись, что сторона клетки обращена вверх, затем обезвожьте покровные листы, последовательно добавляя по два миллилитра 70% 90% и 100% этанола в лунки, позволяя каждому раствору постоять одну-две минуты перед удалением.
С помощью щипцов снимите покровные листы с лунок и положите их на безворсовую салфетку для сушки на воздухе, в защищенном от света месте. Закрепите защитный колышек клеточной стороной вниз на предметные стекла микроскопа, используя 20 микролитров монтажного материала на каждое покровное стекло. Ядерный блеббинг был более распространен в клетках с нокаутом HeLa ZMPST24, где примерно 50% ядер демонстрировали пузырьки, по сравнению с 17% в контрольных клетках HeLa.
Утечка ДНК наблюдалась преимущественно в клетках с нокаутом HeLa ZMPSTE24, в то время как в контрольных клетках утечки ДНК не наблюдалось, утечка ДНК происходила в некоторых ZMPSTE24 нокаутных клетках, даже при отсутствии видимого ядерного блеббинга.
