Наша исследовательская программа направлена на понимание того, как регулируются различные формы клеточной гибели. Как правило, мы изучаем гибель клеток в контексте лечения рака с целью узнать, как лекарства влияют на гибель клеток и как сделать эти реакции более эффективными и специфичными. Становится все более очевидным, что существует множество различных типов регулируемой клеточной гибели.
В настоящее время в этой области выявлено по меньшей мере 14 механически различных типов смерти. Большинство из них вызывают морфологически некротическую смерть, и в целом мы очень мало знаем о том, как работают эти пути. Эффективным способом изучения регуляции клеточной смерти является использование функциональной геномики.
Другими словами, систематически возмущать каждый ген и определять, как эти возмущения влияют на гибель клеток. Когда это выполняется в контексте лекарственных препаратов, это называется хемогенетическим профилированием. Хемогенетический скрининг обычно оценивает, как нокауты генов влияют на окончательный размер популяции.
Тем не менее, на размер популяции могут влиять изменения в темпах роста, смертности или и то, и другое. Современные методы скрининга не могут идентифицировать гены, регулирующие смертность, из-за ограничивающих эффектов изменения темпов роста. Medusa использует моделирование реакции на лекарственные препараты для моделирования того, как изменение темпов роста или смертности влияет на окончательный размер популяции.
Эти симуляции позволяют нам извлечь уровень смертности, вызванной лекарственными препаратами, для каждого гена в скрининге и устранить другие искажающие факторы. Для начала, пластинчатые клетки черного цвета с чистым дном 96 лунок с плотностью посева от 1500 до 5000 клеток на лунку. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и влажностью в течение 16-24 часов. Готовят разведение препарата в средах, содержащих концентрацию цитотокса, оптимизированную ранее.
Изготовьте одну пластину с помощью Triton X в оптимизированной концентрации. Затем поместите планшет в считыватель планшетов и измерьте флуоресценцию цитотокса в экспериментальных планшетах в T0 с использованием оптимизированных настроек, а затем в подходящий более поздний момент времени. После последнего момента времени экспериментальные планшеты используют с помощью Triton X для определения конечного размера популяции каждого состояния.
Рассчитайте дробную жизнеспособность, используя данные конечной точки, и подогните результаты к кривым реакции на дозу. Оцените кривые реакции на дозу, чтобы определить дозы лекарств, которые вызывают гибель клеток примерно на 50%. После оптимизации дозы препарата для индуцирования гибели клеток случайным образом распределите нецелевые SG РНК к нецелевым генам.
Обрезайте SG РНК с низким количеством на основе выбранной стратегии отсечения. Смоделируйте все возможные возмущения чистого темпа роста населения или NPG с помощью цикла for для оценки диапазона значений NPG. Для каждой экспериментальной одиночной SG РНК сопоставьте смоделированное изменение складки, наиболее близкое к наблюдаемым данным, и присвойте SG РНК соответствующую относительную скорость роста.
Затем определите индуцированную лекарством скорость роста до смерти по данным подсчета живых клеток. Подгонка данных к простому экспоненциальному уравнению, чтобы получить темпы роста. Рассчитайте скорость роста, вызванную лекарственными препаратами, после наступления смерти, объединив данные подсчета живых клеток и значения степени препарата.
Нанесите на график уклон для выбранной дозы препарата. Используя экспериментально определенную координацию между вызванным лекарствами ростом и уровнем смертности, создать модель для моделирования размера популяции, вызванной лекарственными препаратами, с течением времени. Затем разработайте модель Medusa, которая включает в себя NPG, темпы роста, вызванные лекарствами, до и после наступления смерти в удвоении в час, а также уровень смертности, вызванной лекарствами.
Установите начальную точку времени на ноль часов и определите конечные временные точки как для необработанных, так и для обработанных состояний. Моделирование всех возможных возмущений роста и смертности для базовой модели. Для каждой комбинации рассчитайте логарифм по основанию два кратного изменения, наблюдаемого в конечной точке анализа.
Для каждой SG РНК триангулируйте уровень смертности, вызванный лекарственным препаратом, который приведет к наблюдаемому изменению кратности. Начните с извлечения заданного относительного темпа роста. Определите темпы роста, вызванного лекарственными препаратами, до и после наступления смерти.
Примените относительный темп роста из НПГ для расчета пропорциональных темпов роста для темпов роста, вызванных лекарственными препаратами, до и после наступления смерти. Используя ограничения для NPG, темпов роста, вызванных лекарственными препаратами, до и после наступления смерти, определить смоделированное изменение складки, наиболее близкое к наблюдаемому изменению складки для каждой РНК SG. Определите уровень роста генов и смертность для каждого гена в библиотеке.
Рассчитайте средние темпы роста и смертности для всех SG РНК, связанных с каждым геном, обычно в диапазоне от 4 до 10 SG РНК. Чтобы рассчитать эмпирические значения P, выполните начальную загрузку данных об уровне SG РНК и примените коррекцию частоты ложных обнаружений с помощью процедуры Бенджамина Хохберга. Фракционная жизнеспособность клеток U2 OS снижалась дозозависимым образом, при этом летальность наблюдалась примерно на 50% при пяти микромолярных этопозидах через 96 часов.
Размер выздоровевшей популяции уменьшился на 40-50% после четырех дней воздействия пятимикромолярного этопозида, что подтверждает гибель клеток во время медикаментозного лечения. Анализ степени показал, что пятимикромолярный этопозид вызывает значительное снижение скорости роста, при этом гибель клеток начинается только после полной остановки роста. Анализ Medusa показал, что пять нокаутных клеток XRCC показали медленный рост в нелеченных условиях и высокие показатели смертности, вызванной лекарственными препаратами, при лечении этопозидами.
Валидационные эксперименты подтвердили, что нокаутирующие клетки XRCC 5 демонстрируют более медленный рост в необработанных условиях и повышенную смертность под действием этопозида, что согласуется с прогнозами Medusa.
