私たちの研究プログラムは、さまざまな形態の細胞死がどのように制御されているかを理解することに焦点を当てています。私たちは一般的に、薬物がどのように細胞死を引き起こす機能を持つのか、そしてこれらの応答をどのように改善し、より特異的に行うのかを学ぶことを目標に、がん治療の文脈で細胞死を研究しています。制御された細胞死にはさまざまな種類があることがますます明らかになっています。
この分野では、現在、少なくとも14種類の機械的に異なるタイプの死が特定されています。これらのほとんどは形態学的に壊死を引き起こし、一般的に、これらの経路がどのように機能するかについてはほとんどわかっていません。細胞死制御を研究する効果的な方法は、機能ゲノミクスを使用することです。
言い換えれば、各遺伝子を系統的に摂動し、これらの摂動が細胞死にどのように影響するかを決定することです。薬物の文脈で行われる場合、これは化学遺伝学的プロファイリングと呼ばれます。化学遺伝学的スクリーニングでは、通常、遺伝子ノックアウトが最終的な集団サイズにどのように影響するかを評価します。
ただし、人口規模は、成長率、死亡率、またはその両方の変化によって影響を受ける可能性があります。現在のスクリーニング法では、成長率の変動による制限効果のために、死亡調節遺伝子を同定できていません。Medusaは、薬物反応のシミュレーションを使用して、成長率または死亡率の変化が最終的な人口サイズにどのように影響するかをモデル化します。
これらのシミュレーションにより、スクリーン内の各遺伝子の薬物誘発死亡率を抽出し、他の交絡因子を取り除くことができます まず、黒のプレート細胞を黒く、クリアボトムの96ウェルプレートに播種密度でウェルあたり1500〜5、000細胞でプレートします。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素と湿度で16〜24時間インキュベートします。細胞毒素濃度を含む培地で薬物希釈を調製し、以前に最適化します。
Triton Xを使用して1枚のプレートを最適な濃度で溶解します。次に、プレートをプレートリーダーに置き、最適化された設定を使用して実験プレートのT0で細胞毒性蛍光を測定し、その後、適切な後の時点で測定します。最終時点の後、Triton Xを使用して実験プレートを溶解し、各条件の最終的な母集団サイズを決定します。
エンドポイントデータを使用して分数生存率を計算し、結果を用量反応曲線に適合させます。用量反応曲線を評価して、約50%の細胞死を誘発する薬物用量を特定します。細胞死を誘導するために薬剤の投与量を最適化した後、非標的SG RNAを非標的遺伝子にランダムに割り当てます。
選択したカットオフ戦略に基づいて、カウントの少ないSG RNAをトリミングします。正味人口増加率 (NPG) に対するすべての摂動をシミュレートするには、for ループを使用して NPG 値の範囲を評価します。各実験用単一SG RNAについて、観察データに最も近いシミュレートされた倍率変化を一致させ、対応する相対成長率をSG RNAに割り当てます。
次に、生細胞計数データから死前の薬物誘発増殖速度を決定します。データを単純な指数方程式に当てはめて、成長率を導き出します。生細胞のカウントデータと薬剤グレードの値を組み合わせて、死亡発症後の薬剤誘発増殖率を計算します。
選択した薬物用量のグレードをグレードプロットにプロットします。実験的に決定された薬物誘発性の成長と死亡率の間の調整を使用して、薬物誘発性の人口サイズを経時的にシミュレートするモデルを作成します。次に、NPG、死亡発症前後の薬物誘発成長率(1時間あたり2倍)、および薬物誘発死亡率を含むメデューサモデルを開発します。
開始時点を 0 時間に設定し、未処理の状態と処理済みの状態の両方の最終時点を定義します。ベースライン モデルについて、成長率と死亡率に考えられるすべての摂動をシミュレートします。各組み合わせについて、アッセイエンドポイントで観察された倍率変化の対数基数2を計算します。
各SG RNAについて、観察された倍率変化を引き起こす薬物誘発死亡率を三角測量します。まず、あらかじめ決められた相対成長率を抽出します。死亡発症前後の薬物誘発性増殖率を決定します。
NPGからの相対成長率を適用して、死亡発症前後の薬物誘発成長率の比例成長率を計算します。NPG、死亡発症前後の薬物誘発増殖速度の制約条件を使用して、各SG RNAの観察されたフォールド変化に最も近いシミュレートされたフォールド変化を特定します。ライブラリ内の各遺伝子の遺伝子レベルの増殖率と死亡率を判定します。
各遺伝子に関連するすべてのSG RNAの平均増殖率と死亡率を計算します(通常は4〜10個のSG RNAの範囲)。経験的なP値を計算するには、SG RNAレベルのデータをブートストラップし、Benjamin Hochberg手順を使用して偽の発見率補正を適用します。U2 OS細胞の分画生存率は用量依存的に減少し、96時間後に5マイクロモルのエトポシドで約50%の致死率が観察されました。
回復した集団サイズは、5マイクロモルのエトポシドへの4日間の曝露後に40%から50%減少し、薬物治療中の細胞死が確認されました。グレード解析では、5マイクロモルのエトポシドが増殖速度の大幅な低下を引き起こし、細胞死は完全な増殖停止後にのみ開始されると予測されました。Medusaの解析により、XRCC 5つのノックアウト細胞は、未治療の状態でゆっくりとした増殖を示し、エトポシド治療下で高い薬物誘発死亡率を示したことが明らかになりました。
検証実験により、XRCC 5ノックアウト細胞は未処理の条件下で増殖が遅く、エトポシド下での死亡率が上昇したことが確認され、これはメデューサの予測と一致しています。
