Это исследование направлено на разработку и внедрение эпигеномных редакторов в клетки человека. Мы делаем это путем слияния эффекторов хроматина с dCas9 для целевой модуляции генов без введения токсичных разрывов ДНК. Проблемы связаны с эффективной доставкой редакторов эпигенома в клетки и обеспечением точной специфичности мишени.
Кроме того, достижение стабильной или транзиторной репрессии генов остается затруднительным. Этот протокол позволяет избежать каких-либо механизмов расщепления, снижая токсичность и геномную нестабильность. В ней описаны два метода доставки для контролируемой модуляции экспрессии генов без необратимых изменений последовательности ДНК.
Эти методы могут быть применены для тестирования различных слияний с dCas9 и для изучения базовой биологии хроматина. Современные редакторы эпигенома могут быть использованы для полногеномного скрининга и имеют потенциал для терапевтического применения. Для начала поддерживайте клетки K-562 в колбе с помощью среды RPMI с добавлением 10% FBS и пенициллина стрептомицина глутамина.
В день нуклеофекции разморозьте мРНК CRISPRoff в стерильной микроцентрифужной пробирке, не содержащей РНКазы, и аккуратно переверните пробирку. Используйте два микрограмма мРНК в соотношении 2,0 умножить на 10 в размере пяти клеток в каждую лунку ПЦР-полосковой пробирки, помещенной на лед. Приготовьте раствор нуклеофекции в соответствии с инструкциями производителя и дайте ему нагреться до комнатной температуры в течение 15 минут до нуклеофекции.
Собирайте и подсчитывайте клетки K-562 с помощью автоматического счетчика клеток с окрашиванием в трипановый синий цвет живых/мертвых. Для нуклеофекции в стрип-кювете аликвоту примерно два раза по 10 в степени пяти клеток на образец в стерильную микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте клетки при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте PBS комнатной температуры в гранулу ячейки и снова центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте клетки в соответствующем количестве раствора нуклеофектора. Добавьте рассчитанный объем клеточного раствора к двум микрограммам раствора CRISPRoff. Перенесите клеточный и мРНК-раствор в кювету, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки, так как это может поставить под угрозу эффективность нуклеофекции.
Осторожно постучите по ядрышку, чтобы клетки расположились на дне. Далее происходит нуклеофектирование клеток с помощью системы 4D-Nucleofector с соответствующим импульсным кодом. Возможно, потребуется оптимизировать код импульса для различных типов ячеек.
Проконсультируйтесь с производителем, если нужна дополнительная оптимизация. После нуклеофекции добавьте 80 микролитров среды RPMI в каждую используемую лунку Nucleocuvette. Перенесите клеточную суспензию в лунку 24-луночного планшета, содержащего 400 микролитров предварительно подогретой среды RPMI.
Загрузите все файлы стандарта проточной цитометрии или FSC в FlowJo, перетащив их на новый лист. Нажмите на все образцы, чтобы приступить к изготовлению ворот. Откройте контрольный образец, дважды щелкнув по соответствующему файлу.
Создайте вентиль для живых клеток на графике FSC-A в сравнении с SSC-A с помощью инструмента полигона. Вкладка живых ячеек теперь должна отображаться под именем образца в списке всех образцов. Щелкните правой кнопкой мыши по этому стробу и выберите Копировать анализ для группировки, чтобы применить этот вентиль ко всем образцам.
Дважды щелкните по воротам живых клеток, чтобы выбрать только живые клетки. Измените оси на FSC-H и FSC-A. Нарисуйте многоугольник к воротам только для отдельных ячеек.
Чтобы создать элемент для направляющих экспрессирующих ячеек, дважды щелкните по элементу одиночной ячейки, чтобы выбрать только одиночные ячейки. Измените оси на FSC-A вместо PE-CF594-A. Нарисуйте ворота для направляющих ячеек, выражающих ячеи, с помощью инструмента многоугольник.
Дважды щелкните по последнему затвору настройки, либо по отдельным ячейкам, либо по направляющим экспрессирующим ячейкам. При проведении трансфекции плазмид, в которой редактор эпигенома кодирует синий флуоресцентный белок, или слияние BFP, создание ворот для BFP-положительных клеток для образцов второго дня. Создайте вентиль для экспрессии репортера, построив график BB515-A против FSC-A для идентификации и гейта для GFP-отрицательных клеток.
Затем примените этот затвор ко всем образцам. После завершения настройки стробирования нажмите на редактор таблиц в верхней панели. Перетащите популяции для анализа, такие как BFP-положительные и GFP-отрицательные клетки.
В панели редактора таблиц нажмите «Создать таблицу» и скопируйте данные перед тем, как вставить их в таблицу для расчетов нормализации. Теперь вычтите количество репортерных отрицательных клеток, таких как GFP-отрицательные, в контрольной выборке из всех остальных образцов. Это корректирует фоновое замалчивание репортера.
При выполнении трансфекции разделите каждое значение на процент BFP-положительных клеток, измеренный на второй день, чтобы нормализовать все значения до процента BFP-положительных клеток, а затем умножьте на 100. Это дает нормализованное значение эффективности трансфекции отредактированных клеток. Построение графиков данных для создания линейных графиков, представляющих изменения во времени редактирования эпигенома.
Для всех экспериментов по редактированию эпигенома рекомендуется использовать нецелевой контроль, чтобы подтвердить, что изменения в целевых локусах являются результатом редактирования эпигенома, а не сверхэкспрессии или неспецифического связывания редактора эпигенома. Важно учитывать метод доставки редактора эпигенома. Трансфекция плазмидной ДНК или нуклеофекция мРНК может быть предпочтительной с учетом экспериментального контекста.
Учет типа клеток, сроков эксперимента, показаний доставки и эффективности доставки может повлиять на предпочтительный метод доставки. Клетки, экспрессирующие высокие уровни BFP через два дня после трансфекции, указывают на успешную трансфекцию с помощью редактора эпигенома. Как CRISPRoff, так и CRISPRi демонстрируют пик сайленсинга гена на пятый день после трансфекции.
В экспериментах по нуклеофекции мРНК сильное подавление экспрессии генов наблюдается на третий день после нуклеофекции с помощью CRISPRoff.
